甲基对硫磷水解酶高活筛选及荧光纳米分子生物传感器的研究

摘要

本研究从E.coli DH5a/pET5a-mph出发,PCR扩增出甲基对硫磷水解酶MPH结构基因,将其克隆进宿主大肠杆菌系统E.coli BL21(DE3)中表达,获得E.coliBL21(DE3)/pET20b(+)-mph重组系统,经金属螯合一步亲和纯化后,即得纯度在90％以上的目的蛋白,从而发展了一种方便、快速、高效生产和纯化甲基对硫磷水解酶的方法。通过采用易错PCR的方法,在大肠杆菌系统中,对MPH进行了酶活力筛选研究。经一轮易错PCR,产生了一个库容量约为10800的易错PCR突变体库,经酶活测定后,筛选得到2株具有高活力的突变株A7(R41H)和E6(R49P/G117D),其对底物甲基对硫磷MP催化活性分别是野生型的约2和3倍。
　　 本研究同时还以甲基对硫磷水解酶MPH为识别元件,对pH值敏感的E2GFP为换能元件构建了一个检测有机磷农药的荧光生物分子传感器E2GFP-MPH。为了进一步提高该生物传感器的检测灵敏度,将酵母淀粉样蛋白Sup351-61的基因与E2GFP-MPF融合,得到一种能自组装成蛋白纳米线的生物传感器Sup351-61-E2GFP-MPH。实验表明,此纳米线生物传感器的检测灵敏度在荧光生物分子传感器E2GFP-MPH的基础上提高了约10,000倍,对甲基对硫磷的检测下限为1pmol/mL。

目录

文摘

英文文摘

第一章 有机磷农药污染及其检测

1 有机磷农药的概述

1.1 有机磷农药使用现状

1.2 有机磷农药的分类

1.3 有机磷农药的毒性问题

1.4 有机磷农药的环境污染和残留问题

1.5 农药污染的防治措施

2 有机磷农药降解酶的研究进展

2.1 有机磷农药降解微生物的分离

2.2 有机磷水解酶的研究进展

2.3 甲基对硫磷水解酶的研究现状

3 农药残留检测的研究进展

3.1 色谱法(Chromotography)

3.2 毛细管电泳(Capillary Electropheresis)

3.3 光谱法

3.4 生物传感器

3.5 结束语

第二章 甲基对硫磷水解酶的高酶活筛选研究

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 实验方法

2 结果

2.1 mph基因表达载体的构建

2.2 MPH的表达纯化

2.3 MPH的体外定向筛选试验设计和突变文库的筛选

3 讨论

第三章 荧光纳米传感器检测甲基对硫磷的研究

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 实验方法

2 结果

2.1 几种融合蛋白基因表达载体的构建

2.2 几种融合蛋白的纯化

2.3 恒pH滴定

2.4 酶催化、反应体系pH值变化与荧光强度变化之间的相关性

2.5 刚果红染色

2.6 Sup351-61-E2GFP-MPH纳米线的透射电镜表征

2.7 MPH、E2GFP-MPH和Sup351-61-E2GFP-MPH成线蛋白酶学活性测定

2.8 Sup351-61-E2GFP-MPH成线蛋白荧光强度随pH值变化的测定

2.9 利用E2GFP-MPH、Sup351-61-E2GFP-MPH成线蛋白检测MP

2.10 MPH-E2GFP和Sup351-61-E2GFP-MPH成线蛋白荧光强度残留随时间变化的比较

3 讨论

3.1 一种新型的pH值敏感的荧光生物分子传感器的构建

3.2 纳米自组装荧光生物分子传感器的构建

4 小结

参考文献

论文及专利

致谢