枯草芽胞杆菌TR21的发酵和海洋细菌DM09的抗真菌活性物质研究

摘要

本论文共包括两部分工作:一部分是对抗香蕉枯萎病4号小种的枯草芽胞杆菌TR21进行了发酵条件优化及田间防效的测定；另一部分是对分离自深海的广谱抗真菌芽胞杆菌进行了快速分子鉴定,并对其产生的抗真菌物质进行了分离鉴定。
　　 1.香蕉枯萎病是引起维管束坏死的一种毁灭性真菌病害和典型的土传病害,严重影响我国香蕉生产。分离自石斛兰叶片的枯草芽胞杆菌TR21对香蕉枯萎病病原菌Fusarium oxysporum f.sp.Cubense有很好的拮抗效果。研究发现该菌的防效和芽胞数成正相关,提高芽胞数可以提高经济效益并降低成本。本研究对TR21的产芽胞培养基进行了优化,并对TR21的田间防效进行了测定。结果如下:
　　 首先确定筛选培养基:玉米粉10 g/L,豆粕粉9 g/L。然后对适合TR21产芽胞的碳源、氮源和无机盐进行了筛选,得到了基础配方:玉米粉10 g/L,豆粕粉9 g/L,KH2PO43 g/L。初始pH7.5。然后运用田口稳健设计方法对基础培养基各营养物的浓度及碳氮源搭配进行了优化,主要选择五个因素:初始pH,碳源总量,氮源总量,玉米粉浓度,豆粕粉浓度,KH2PO4。经过信噪比优化得出了优化条件:初始pH7.0.玉米粉8 g/L,葡萄糖12 g/L,豆粕粉16 g/L,氯化铵4 g/L,磷酸二氢钾2 g/L,芽胞产量达到19.6×108cfu/mL,比未优化的过程(7.0×108)提高了2.8倍。在珠海对TR21的田间防效进行了测定:处理组发病率明显低于对照组发病率,TR21的田间防效可以达到66.95％。
　　 2.核盘菌[Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary)]是一种世界性分布的重要植物病原真菌,在我国严重威胁油菜生产。生物防治控制核盘菌是目前菌核病防治研究的重点方向。我们分离到一株对核盘菌有显著拮抗作用的来自深海的芽胞杆菌DM09,对其进行了分类研究,对其拮抗活性物质进行了分离纯化,结果如下:
　　 首先通过16S rDNA序列分析,分析其属于芽胞杆菌属,但不能准确鉴定到种；利用gyrB基因blast结果构建系统发育树,最终将该菌株确定为B.velezensis。结果显示利用16S rDNA和gyrB基因组合可以快速准确的鉴定枯草芽胞杆菌组内的近缘种。然后以核盘菌为指示菌,首先通过酸沉淀实验、两步超滤实验推断出活性物质是脂肽类物质。随后用酸沉淀、两步超滤、固相萃取、液相色谱的方法纯化了脂肽类物质。经过ESI-MS串联质谱鉴定,活性物质分子量为1043.7Da和1057.7Da,两种活性物质的一级结构均为Pro-Asn-Tyr-βAA-Asn-Tyr-Asn-Gln(βAA为14个和15个碳原子的氨基脂肪酸),属脂肽类抗生素伊枯草菌素及其同系物。这也是首次在B.velezensis中发现伊枯草菌素。

目录

文摘

英文文摘

第一部分 抗香蕉枯萎病4号小种枯草芽胞杆菌TR2l的发酵条件优化及田间防效测定

1 前言

1.1 香蕉枯萎病危害概况

1.2 国内外香蕉枯萎病生物防治概况

1.3 培养基配方优化方法概况

2 材料和方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

3 结果和分析

3.1 TR21的形态学观察

3.2 碳源筛选结果

3.3 氮源筛选结果

3.4 无机盐筛选实验

3.5 田口设计优化TR2l的发酵培养基

3.6 TR21防治巴西蕉枯萎病的田间试验

4 讨论

第二部分 抗油菜核盘菌海洋细菌的快速分子鉴定和抗菌活性物质研究

1 前言

1.1 油菜核盘菌危害及生物防治概况

1.2 海洋细菌活性物质研究概况

1.3 解淀粉芽胞杆菌生物防治研究概况

2 材料和方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

3 结果和分析

3.1 16S rDNA和gyrB基因序列的克隆

3.2 基于16S rDNA基因的BLAST结果

3.3 基于gyrB基因Blast结果的系统进化分析

3.4 活性物质特性研究

3.5 脂肽分离纯化和结构鉴定

4 讨论

参考文献

致谢