苏云金芽胞杆菌幕虫亚种菌株YBT-020中p26质粒复制区功能鉴定

摘要

苏云金芽胞杆菌幕虫亚种YBT-020包含3个内生大质粒，本课题组前期从质粒p26上克隆到一类新型的复制子，该复制子共由两个ORF组成：ORF15和ORF16。序列比对发现，orf15编码一个未知功能蛋白，预测这个蛋白可能是一类新型的复制蛋白；orf16编码一个与PcrA解螺旋酶的7个保守结构域有很高同源性的蛋白，故命名为PcrA26。为了证明ORF15蛋白是否是一个新型的复制蛋白，同时明确PcrA26蛋白是否具有解螺旋酶的功能，以及它们在p26复制过程中所执行功能的机制，开展了本研究。
　　1.通过预测知道p26质粒的ORI位点位于orf15的内部，然后利用PGE超量表达系统在大肠杆菌中表达纯化了ORF15蛋白；在体外将ORF15蛋白与前面预测含有ORI位点的DNA片段进行结合实验，结果证明ORF15蛋白能够与该DNA相结合并具有复制起始蛋白的功能，故将ORF15命名为Rep26；
　　2.通过酵母双杂交实验验证Rep26蛋白和PcrA26之间的相互作用及其各自之间的聚合作用，结果表明Rep26可以自身聚合成寡聚体，推测这个蛋白除了和复制起始相关外，还可能与p26质粒的分离机制相关，是一个杂合功能蛋白。PcrA26自身不能聚合，说明PcrA26是以单体的形式起作用；PcrA26和Rep26没有相互作用关系，推测PcrA26执行解螺旋酶的功能不依赖复制蛋白。
　　本研究初步鉴定了p26的复制子的功能，Rep26是一类新型的复制起始蛋白，同时推测这个蛋白在质粒的分离中起作用，是一个具有复制和分离的双功能蛋白。PcrA26在θ复制中执行功能时是以单体形式起作用的，并且被招募时不需要Rep蛋白的参与，推测PcrA26蛋白直接和复制区的DNA相结合，基于以上证据推测p26质粒可能存在一种新的复制机制。

目录

声明

缩略语表

1 前言

1.1质粒的复制类型及其分类

1.1.1质粒的滚环复制机制

1.1.2 质粒的θ复制机制

1.2 解螺旋酶在质粒复制中的作用简介

1.2.1 解螺旋酶的特征及分类

1.2.2 细菌质粒复制起始中解螺旋酶的特征

1.2.3 与复制相关的解螺旋酶

1.2.4 DnaB解旋酶的招募和装配

1.3 苏云金芽胞杆菌质粒的研究简介

1.4 本实验的研究背景

1.5本研究的意义

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 菌株、质粒和引物

2.1.2 培养基

2.1.3 细菌用抗生素及其培养温度

2.1.4 试剂和仪器

2.2 实验方法

2.2.1 分子生物学基本操作

2.2.2 酵母双杂交实验

2.2.3 蛋白质浓度的测定

2.2.4 EMSA(琼脂糖凝胶阻滞实验)

3 结果与分析

3.1 ORF15蛋白的超量表达与纯化

3.1.1 构建表达ORF15蛋白的重组菌株及ORF15蛋白的超量表达

3.1.2 ORF15蛋白的纯化

3.2 PcrA26蛋白的超量表达与纯化

3.2.1构建表达PcrA26蛋白的重组菌株及PcrA26蛋白的超量表达

3.3 ORF15蛋白与复制起始区段(ORI)之间的结合实验

3.3.1 复制起始区段(ORI)的PCR扩增

3.3.2 EMSA实验验证ORF15蛋白与复制起始区段(ORI)之间的结合实验

3.4 酵母双杂交实验体内验证蛋白质之间的相互作用

3.4.1 酵母双杂交重组质粒的构建

3.4.2 酵母双杂交

4. 讨论

5. 小结

参考文献

致谢