重组杆状病毒介导的高致病性猪繁殖与呼吸综合征基因工程疫苗研究

摘要

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种能够导致母猪严重繁殖障碍及仔猪呼道症状和高死亡率的病毒性传染病。免疫接种一直是预防病毒性传染病的最主要手段，但目前针对PRRS的商品化灭活苗和弱毒苗存在免疫效果不理想或不安全的缺陷，尤其是近年来，由于高致病性PRRSV毒株的出现，由经典PRRSV毒株制备的疫苗更是难以诱导针对高致病性PRRSV的有效保护性免疫反应，因此急需研制针对高致病性PRRSV的新型疫苗。
　　 SFV复制子载体是基于西门利克森林病毒的真核表达载体，它不仅具有自主复制功能，能够高水平表达外源基因，而且具有诱导宿主细胞凋亡的特性。杆状病毒是目前一种应用十分广泛的载体，主要用于基因治疗和疫苗开发等领域。研究发现，杆状病毒载体可以携带哺乳动物启动子驱动的外源基因表达盒进入哺乳动物细胞，从而使外源基因得到高效及稳定的表达。若经过适当的修饰或预处理，还可介导外源基因在哺乳动物体内进行表达，而其自身基因组并不复制和表达。
　　 基于杆状病毒的高转导效率及SFV复制子的自主复制和诱导细胞凋亡的优势，同时为了消除杆状病毒的补体敏感性，本研究利用囊膜表面展示水泡性口炎病毒G蛋白的假型杆状病毒载体，构建了基于SFV复制子的，共表达高致病性PRRSVWUH3株ORF3、ORF4、ORF5(修饰的ORF5)、ORF6四个结构蛋白基因的重组杆状病毒BV-G-CMV/SFV-ORF3/4/5/6，并对其免疫原性进行了评价。具体研究内容如下：
　　 1.“自杀性”DNA疫苗pSCA1-CMV/SFV-ORF3/4/5/6的构建。
　　 扩增高致病性PRRSVWUH3株的ORF3、ORF4、ORF5（修饰的ORF5）、ORF6基因以及西门利克森林病毒的26s亚基因组启动子，分别构建了由26s亚基因组启动子驱动的ORF3、ORF4、ORF5(修饰的ORF5)、ORF6基因的表达盒，进一步插入“自杀性”DNA疫苗表达载体pSCA1，获得共表达ORF3、ORF4、ORF5（修饰的ORF5）、ORF6基因的“自杀性”DNA疫苗pSCA1-CMV/SFV-ORF3/4/5/6。
　　 2.重组杆状病毒BV-G-CMV/SFV-ORF3/4/5/6的构建。
　　 用SpeI和Sph1分别双酶切质粒pSCA1-CMV/SFV-ORF3/4/5/6和载体pFastBac-VSV/G，将获得的片段CMV/SFV-ORF3/4/5/6插入到载体pFastBac-VSV/G中，得到穿梭质粒pFastBac-VSV/G-CMV/SFV-ORF3/4/5/6。将构建的穿梭质粒转化DH10Bac感受态细胞，三抗筛选阳性重组子并提取重组Bacmid，经脂质体介导转染sf9昆虫细胞，获得共表达ORF3、ORF4、ORF5（修饰的ORF5）和ORF6基因的重组杆状病毒BV-G-CMV/SFV-ORF3/4/5/6。
　　 3.重组杆状病毒BV-G-CMV/SFV-ORF3/4/5/6在小鼠体内诱发的保护性免疫反应。
　　 将构建的重组杆状病毒BV-G-CMV/SFV-ORF3/4/5/6以3种不同的剂量（109pfu/只，108pfu/只，107pfu/只）经后腿肌肉注射免疫Balb/c小鼠，同时与共表达相同基因的“自杀性”DNA疫苗pSCA1-CMV/SFV-ORF3/4/5/6进行比较。结果表明构建的重组杆状病毒能诱导更强的免疫反应，并呈明显的剂量依赖性，其中109pfu免疫组所诱导的免疫反应最强，首免6周后针对GP5蛋白和全病毒的ELISA抗体滴度分别达到1:4480和1:11200，针对经典毒株CH-1a株和高致病性毒株WUH3株的中和抗体分别达到1:39和1:45以上，ELISA检测IFN-γ水平达1065pg/mL以上，与“自杀性”DNA疫苗免疫组相比，均差异极显著（P＜0.01）。表明重组杆状病毒BV-G-CMV/SFV-ORF3/4/5/6是一种具有良好发展前景的猪繁殖与呼吸综合征候选疫苗。

目录

文摘

英文文摘

缩略语表( Abbreviation)

1 文献综述

1.1 猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)

1.1.1 猪繁殖与呼吸综合征及其病原特征

1.1.2 PRRSV的基因组结构与蛋白质

1.1.3 PRRS的流行病学特点

1.1.4 PRRSV的免疫学反应

1.1.5 PRRS疫苗研究进展

1.2 甲病毒复制子

1.2.1 甲病毒的基因组结构

1.2.2 “自主复制型”RNA疫苗

1.2.3 “自杀性”DNA疫苗

1.3 杆状病毒表达系统

1.3.1 杆状病毒的生物学特点

1.3.2 杆状病毒表达系统

1.3.3 杆状病毒作为哺乳动物细胞表达载体在疫苗研究中的应用

2 研究的目的与意义

3 材料与方法

3.1 试验材料

3.1.1 毒株、细胞与菌株

3.1.2 载体与质粒

3.1.3 工具酶及主要试剂

3.1.4 培养基、抗生素的配制

3.1.5 免疫反应试验所用抗原及血清

3.1.6 主要缓冲液及相关试剂的配制

3.1.7 试验动物

3.2 试验方法

3.2.1 限制性酶切反应

3.2.2 PCR产物或酶切产物的电泳检测

3.2.3 线性质粒DNA末端去磷酸化

3.2.4 PCR产物或酶切产物回收与纯化

3.2.5 外源DNA片段与质粒载体的连接反应

3.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备（氯化钙法）

3.2.7 连接产物的转化

3.2.8 质粒的制各与鉴定

3.2.9 重组杆状病毒构建的操作流程及示意图

3.2.10 重组穿梭载体(Bacmid)的构建

3.2.11 重组穿梭载体(Bacmid)的提取

3.2.12 重组Bacmid转染Sf9细胞（脂质体介导的转染法）

3.2.13 重组杆状病毒的获得

3.2.14 重组杆状病毒转导BHK细胞

3.2.15 Westernblot检测目的蛋白在真核细胞中的表达

3.2.16 GP5-ELISA试验及PRRSV全病毒ELISA试验

3.2.17 微量中和试验（固定病毒-稀释血清法）

3.2.18 细胞免疫的检测

3.2.19 动物试验

3.2.20 统计学方法

4 结果与分析

4.1 穿梭质粒的构建

4.4.1 中间质粒pSCA1-CMV/SFV-ORF3/4/5/6的构建

4.1.2 穿梭质粒pFastBac-VSV/G-CMV/SFV-ORF3/4/5/6的构建

4.2 重组Bacmid-G-CMV/SFV-ORF3/4/5/6的构建

4.3 重组杆状病毒的获得

4.4 重组杆状病毒毒价的测定

4.5 Westernblot检测目的蛋白在真核细胞中的表达

4.6 重组杆状病毒在小鼠体内的免疫效率检测

4.6.1 免疫小鼠的ELISA抗体水平

4.6.2 特异性抗猪繁殖与呼吸综合征病毒中和抗体检测

4.6.3 免疫小鼠脾淋巴细胞分泌的IFN-γ水平检测

4.6.4 荧光定量PCR方法分析免疫小鼠脾淋巴细胞IFN.γ的mRNA水平

5. 讨论与结论

5.1 讨论

5.1.1 PRRS的保护性抗原基因

5.1.2 杆状病毒载体及甲病毒复制子

5.2 结论

参考文献

致谢