甲磺酸达氟沙星明胶微球的制备及药动学和肺靶向性的研究

摘要

甲磺酸达氟沙星(Danofloxacin Mesylate,DFM)是一种动物专用氟喹诺酮类药物,具有抗菌谱广、杀菌活性强、吸收迅速、体内分布广等特点,被广泛用于防治动物的细菌性疾病和支原体病。但是DFM的常规制剂在动物体内的消除快,所以临床使用时必须增加治疗次数。而作者将DFM制成明胶微球(Gelatin Microspheres,GMS),可以延长DFM在动物体内的作用时间,并且能够提高DFM在动物体内的杀菌力。因此,可以减少在临床中的用药次数,为兽医临床提供便利。
　　 本研究选择具有可生物降解、廉价且无毒的明胶为载体,采用化学-交联法制备甲磺酸达氟沙星明胶微球(Danofloxacin Mesylate Gelatin Microspheres,DFM-GMS)。在制备空白GMS时,通过单因素试验考察乳化温度、搅拌速度、乳化剂浓度、明胶浓度、水相与油相的体积比(Water/Oil phase volume ratio,W/O)和交联剂用量对GMS的外观、粒径、粘连度和粒径分布的影响。结果发现搅拌速度、明胶浓度、乳化剂浓度和交联剂用量对GMS的制备工艺影响较大。然后结合单因素试验中各主要影响因素的设置水平,确定正交试验设计中的主要因素及各因素的具体水平,然后通过L9(34)正交表进行正交试验,试验结果通过极差分析确定各个因素的主次顺序,以及各因素的最佳水平。
　　 在空白GMS最佳工艺的基础上,按照与明胶不同的比例添加DFM,进行制备DFM-GMS,并进行外观、粒径、粘连度、粒径分布、载药量和包封率分析。结果显示,不同比例制备的DFM-GMS的载药量和包封率均较低。在此基础上考察了文献报道的能够提高制剂载药量和包封率的多种附加剂,最后确定采用聚乙二醇(Poly(ethylene glycol),PEG),并进行了PEG6000/明胶的单因素考察。
　　 本试验制备DFM-GMS的最佳工艺为:称取DFM0.30g、明胶1.20g和PEG60000.24g溶于8.0 mL水中,于60℃的水浴中预热至均一的溶液,即为水相。量取液体石蜡60mL于250mL圆底烧瓶中,加入Span-801.8mL,混合均匀,即为油相。将油相装入磁力加热搅拌器,温度调至60℃,转速设定为1000r/min,待预热均匀后,将水相滴加到油相中,乳化15min。乳化结束,立即换为冰浴,使温度稳定在0～5℃,将戊二醛(25％)2.5mL滴加到体系中,使反应持续90min。向体系中加入脱水剂异丙醇120mL,进行脱水30min。待脱水完全后,依次用异丙醇、乙醚和石油醚将体系中的油相、过量的戊二醛通过洗涤除去。得到的固体微球放入干燥器,通过循环水真空泵将微球进行室温干燥24h,即DFM-GMS,转入安瓿瓶中密封保存。按照此工艺,制备的DFM-GMS为形状规则、圆整、表面具有许多微孔的球体,平均粒径为10.25±0.69μm,粘连度为17.07±2.19％,分布于5～3μm的微球比例为92.28±0.63％,载药量为33.30±8.12mg/g,包封率为92.15±1.69％。在DFM-GMS体外释放度试验中,以pH7.4的磷酸缓冲液(Phosphate Buffer Solution,PBS)为释放介质,温度为37±0.5℃,转速为50r/min,试验得到的释放数据符合Higuchi方程。绘制的累计释放度-时间曲线与DFM原料药相比,具有明显的缓释效果。加速试验和强光照射试验的结果表明,DFM-GMS的性状稳定,可供长期保存。
　　 DFM-GMS在猪体内的药物动力学试验,采用反向高效液相色谱(Reversed PhaseHigh-performance Liquid Chromatography,RP-HPLC)检测方法。建立的DFM在猪血浆中的标准工作曲线,在0.02～2μg/mL的线性关系良好,相关系数为0.9996。DFM在猪血浆中的绝对回收率均在75％以上,日内变异系数小于5％,日间变异系数小于10％。以DFM原料药为对照,通过考察DFM-GMS以2.5mg/kg·bw的剂量(以DFM计)对猪单次肌内注射后血浆中DFM的药动学特征,得到的二者的药时数据均符合有吸收二室模型。DFM组和DFM-GMS组的主要药物动力学参数为:吸收半衰期(Absorption half-life,T1/2ka)分别为0.15±0.01和0.91±0.12h；达峰时间(Peaktime,Tp)分别为0.64±0.13和2.62±0.11h；峰浓度(Peak concentration,Cp)分别为0.45±0.09和0.39±0.02μg/mL；消除半衰期(Elimination half-life,T1/2β)分别为6.61±0.74和24.32±1.61h；平均滞留时间(Mean Residence Time,MRT)分别为10.01±0.85和31.54±0.69h；药时曲线下面积(Area Under Curve,AUC)分别为3.34±0.43和9.97±0.81μg·h/mL。经统计学分析得知,DFM组和DFM-GMS组的T1/2ka、Tp、T1/2β、MRT、AUC均具有极显著性差异(p<0.01)。通过以上主要药物动力学参数对比显示,将DFM原料药制成DFM-GMS,能够改变DFM在动物体内的药动学特征,延长药物在体内的有效作用时间。
　　 在考察DFM-GMS在大鼠血浆和肺组织的DFM分布试验中,建立的DFM在大鼠血浆和肺组织中的标准工作曲线,分别在0.025～21μg/mL和0.05～4μg/mL的线性关系良好,相关系数均为0.9996。DFM在大鼠血浆和肺组织中的绝对回收率分别在85％和75％以上,日内变异系数均小于5％,日间变异系数均小于10％。以DFM为对照,通过DFM-GMS以20 mg/kg·bw的剂量(以DFM计)对大鼠单次尾静脉注射后,得到的血浆和肺组织中的DFM浓度比值,发现将DFM制成DFM-GMS,可以增加DFM在肺组织内的富集,从而增强DFM防治动物呼吸系统疾病的效果。

目录

文摘

英文文摘

缩略语表

1 前言

1.1 研究背景

1.2 研究内容和目标

1.3 研究目的和意义

2 DFM-GMS的制备

2.1 材料与方法

2.1.1 药品与试剂

2.1.2 主要仪器设备

2.1.3 DFM-GMS制备与评价指标测定方法

2.1.4 空白GMS制备工艺的优化

2.1.5 DFM-GMS的制备

2.2 结果

2.2.1 空白GMS的制备

2.2.2 DFM-GMS的制备

2.3 讨论

2.3.1 乳化温度对微球制备工艺的影响

2.3.2 搅拌速度对微球制备工艺的影响

2.3.3 乳化剂用量对微球制备工艺的影响

2.3.4 明胶浓度对微球制备工艺的影响

2.3.5 W/O对微球制备工艺的影响

2.3.6 交联剂对微球制备工艺的影响

2.3.7 PEG对微球载药量、包封率和突释率的影响

2.4 小结

3 DFM-GMS的特性考察

3.1 材料与方法

3.1.1 药品与试剂

3.1.2 所需溶液配制

3.1.3 主要仪器设备

3.1.4 DFM-GMS粒径测定和微球形态观察

3.1.5 DFM-GMS中DFM的药物含量测定

3.1.6 体外释放度试验

3.1.7 DFM-GMS稳定性考察

3.2 结果

3.2.1 DFM-GMS粒径和外观形态观察结果

3.2.2 DFM-GMS中DFM的载药量和包封率测定结果

3.2.3 DFM-GMS的体外释放度试验结果

3.2.4 DFM-GMS稳定性试验结果

3.3 讨论

3.3.1 微球的粒径测定方法与消化方式

3.3.2 微球的体外释放特征

3.4 小结

4 DFM-GMS在猪体内的药动学研究

4.1 材料与方法

4.1.1 药品与试剂

4.1.2 所需溶液配制

4.1.3 主要仪器设备

4.1.4 试验动物与饲料

4.1.5 药物动力学试验方案

4.1.6 血浆中DFM的测定方法

4.1.7 数据处理与分析

4.2 结果

4.2.1 DFM在血浆中的色谱行为

4.2.2 DFM在血浆中的标准工作曲线和线性范围

4.2.3 准确度和精密度考察结果

4.2.4 灵敏度考察结果

4.2.5 DFM-GMS和DFM药物动力学数据

4.3 讨论

4.3.1 血浆中DFM的萃取与分离

4.3.2 色谱条件的选择

4.3.3 药物动力学特征

4.4 小结

5 DFM-GMS在大鼠血浆和肺组织的分布考察

5.1 材料与方法

5.1.1 药品与试剂

5.1.2 所需溶液配制

5.1.3 主要仪器设备

5.1.4 试验动物与饲料

5.1.5 动物试验方案

5.1.6 色谱条件

5.1.7 样品的处理

5.1.8 标准工作曲线的建立

5.1.9 准确度和精密度考察

5.1.10方法灵敏度的考察

5.2 结果

5.2.1 DFM的色谱行为

5.2.2 DFM在血浆和肺组织中的标准工作曲线

5.2.3 准确度和精密度考察结果

5.2.4 灵敏度考察结果

5.2.5 大鼠血浆及肺组织中DFM浓度的对比分析

5.3 讨论

5.3.1 DFM的体内分布特征

5.3.2 DFM-GMS的分布特征

5.4 小结

参考文献

致谢

附录1 个人简历

附录2 单因素试验中微球的粒径分布

附录3 标准工作曲线

附录4 含量测定、释放度及生物样品测定DFM的色谱图