利用半夏凝集素构建内生工程菌及其抗同翅目害虫效果研究

摘要

本研究对水稻和油菜进行内生菌的分离,各自分离到了66和63株细菌,其中杆菌、革兰氏阳性菌,有芽胞的占优势。SJ-10和YY-23分别为水稻和油菜内生菌,经生理生化、16SrRNA序列鉴定及构建16SrRNA系统进化树,YY-23鉴定为苏云金芽胞杆菌,SJ-10属于肠杆菌属。WB800为枯草芽胞杆菌。以灌根,浸种及接种无菌苗等方法回接水稻和油菜,定殖回收结果表明SJ-10、WB800和YY-23能在水稻和油菜体内长期定殖。且三株菌均可在小麦、玉米、油菜、红菜苔、萝卜等多种植物体内定殖,SJ-10和WB800在三个月后仍可以从上述植物中分离到,YY-23在两个月后可以分离到。菌液浸种24h后播种,20天后,经SJ-10浸种后油菜鲜重比对照增加了52.5％,经YY-23浸种后油菜的鲜重比对照增加了113.5％。经WB800浸种30天后水稻的鲜重比对照增加了62.16％。
　　 利用半夏凝集素(PTA)构建分泌表达穿梭载体,转入水稻内生菌SJ-10和WB800中,进行SDS-PAGE及Western Bloting分析,SJ-10转化子的菌体蛋白和WB800转化子上清的中可以检测到PTA,两菌进行抗虫实验分析结果表明PTA可以明显的抑制白背飞虱的群体增长量。19天时群体数量达到最大值,此时对照的白背飞虱的群体数量是SJ-10-PTA的3.38倍,是WB800-PTA的98.7倍。到26天时CK与WB800-PTA自背飞虱的数量降为0,且CK和SJ-10试验苗在此时全部死亡。WB800、SJ-10-PTA与WB800-PTA试验苗生长正常。
　　 将内生菌SJ-10和YY-23添加到人工营养液中饲喂棉蚜,SJ-10在饲喂第6天时存活率比对照明显降低,差异显著(P<0.05),而YY-23无抗虫活性。
　　 上述结果表明三株内生菌能稳定在植物体内定殖,并具有促生长作用,重组菌SJ-10和WB800有明显的抗白背飞虱活性,野生菌SJ-10同时具有一定的抗蚜虫活性。因此植物内生菌可作为宿主菌,表达抗虫蛋白,用于抗刺吸式口器同翅目害虫。

目录

文摘

英文文摘

缩略语表(Abbreviations)

1 文献综述

1.1 引言

1.2 植物内生菌简介

1.2.1 植物内生菌概念

1.2.2 植物内生菌的普遍性与多样性

1.2.3 内生菌的传播方式与分类

1.2.4 植物内生菌的生物学作用

1.2.5 植物内生菌的活性物质

1.2.6 植物内生菌与宿主植物相互作用的有关机制

1.2.7 内生菌的应用与存在的问题

1.3 凝集素简介

1.3.1 凝集素概念与分布

1.3.2 植物凝集素的分类

1.3.3 植物凝集素的功能

1.3.4 植物凝集素的抗虫机制

1.3.5 植物凝集素的应用与存在问题

1.4 本论文的研究目的

2 材料和方法

2.1 材料

2.1.1 菌株、质粒与供试作物

2.1.2 所用培养基

2.1.3 所用溶液

2.1.4 化学试剂与试剂盒

2.1.5 器材

2.2 方法

2.2.1 水稻和油菜内生细菌的分离

2.2.2 内生菌电镜观察、生理生化、16SrRNA扩增及系统进化树的构建

2.2.3 DNA分子操作

2.2.4 定殖回收、定殖范围测定及促生长试验

2.2.5 SDS-PAGE电泳及Western bloting分析

2.2.6 抗虫分析

3 结果与分析

3.1 内生细菌的分离结果

3.2 菌体形态观察、生理生化及16SrRNA鉴定

3.3 DNA分子操作实验结果与分析

3.3.1 pP43NMK-pta载体的构建

3.3.2 SJ-10及WB800转化及鉴定结果

3.4 定殖回收、定殖范围测定及促生长试验

3.4.1 YY-23和SJ-10在油菜体内的定殖回收

3.4.2 定殖回接水稻

3.4.3 定殖范围测定

3.4.4 促生长结果

3.5 SDS-PAGE电泳及Western bloting分析

3.6 抗虫分析

3.6.1 内生工程菌在水稻中定殖及抗白背飞虱实验分析

3.6.2 抗蚜虫分析

4 讨论

参考文献

致谢

附录 Ⅰ

附录 Ⅱ