利用天南星科凝集素构建内生工程真菌及其抗虫防病效果研究

摘要

随着环境问题的日益凸显,大力发展绿色农业成为实现农业可持续发展的必要手段。微生物农药作为生物农药的主力军在生物防治领域越来越受到人们的青睐。植物内生菌因其生境的特殊性,为植物病虫害的防治和微生物农药的开发提供了新的思路和更为广阔的研究领域。本研究就是从油菜内生真菌中筛选到一株具有广谱抑菌活性的内生真菌毛壳菌YY-11,对其抗菌机理,在作物中的定殖范围进行了研究,在此基础之上,利用天南星科凝集素构建了具有抗虫和抗病双重功效的工程毛壳菌,用于生物防治,具体实验结果如下所示:
　　 (1)从油菜中分离到9株内生真菌,通过孢子形态学观察和18S rRNA基因序列分析对其进行了鉴定,其中有6株为链格孢菌(Alternaria alternata)；一株为球毛壳菌(Chaetomium globosum)；另两株分别属于镰刀菌属(Fusarium)和炭角菌目(Xylariales)。
　　 (2)筛选到一株具有很好抑菌活性的内生球毛壳菌(YY-11),平板对峙试验结果表明该菌对立枯丝核(Rhizoctonia solani)、油菜灰霉(Botrytis cinerea)、油菜菌核(Sclerotinia sclerotiorum)、小麦赤霉(Fusarium graminearum)等植物病原菌具有不同程度的抑制作用；玻片对峙镜检结果显示,在球毛壳菌(YY-11)对立枯丝核的抑制过程中,拮抗机理主要是重寄生,作用方式为侵入、缠绕、贴附病原菌生长等。
　　 (3)通过回接分离试验,研究了球毛壳菌(YY-11)的定殖范围,结果表明YY-11寄主范围广泛,可以定殖多种重要的农作物如油菜、小麦、水稻、棉花、萝卜和玉米等,且定殖时间长,一百天后依然能够从回接苗中分离得到该菌。通过扫描电镜和透射电镜观察了YY-11与油菜幼根的互作,结果表明,YY-11菌丝可以从细胞间隙侵入寄主,并在其根、茎及叶片内定殖。
　　 (4)利用天南星凝集素(Arisaema heterophyllum agglutinin,AHA)和半夏凝集素(Pinellia ternata agglutinin,PTA)构建了两个表达载体pCAM1301-AHA和pCAM1301-PTA,通过根癌农杆菌介导分别转化球毛壳菌(YY-11),转化子(T2、Te和P6)通过潮霉素抗性、PCR、SDA-PAGE及Western blotting分析,证明外源基因已整合到了重组菌基因组内,并可检测到PTA和AHA蛋白的表达。
　　 (5)抗虫活性检测结果表明,回接重组内生真菌的油菜苗可以有效抑制蚜虫的生长和繁殖,从第五天开始,回接转化子的处理组,其植株上寄生的蚜虫数目均已极显著少于对照组(1％显著水平),并且这一趋势在随后的统计中一直稳定地维持,虽然中间存在一定的起伏,但是仍然维持着显著的差异(5％显著水平)。并且回接重组毛壳菌的油菜苗可以有效抵制核盘菌的侵染。
　　 上述结果表明,内生球毛壳菌YY-11寄主范围广泛且定殖稳定,具有广谱抑菌活性。构建的重组菌具有明显的抗虫和抗病活性。因此,植物内生真菌可作为载体表达抗虫蛋白,用于病虫害的生物防治。

目录

文摘

英文文摘

缩略词表

1 前言

1.1 微生物农药的研究现状及展望

1.1.1 微生物农药的定义和分类

1.1.2 微生物农药的特点

1.1.3 微生物农药的应用现状

1.1.4 微生物农药应用存在问题和展望

1.2 植物内生真菌的研究概况

1.2.1 植物内生真菌的定义

1.2.2 植物内生真菌的生物多样性

1.2.3 植物内生真菌与宿主的关系

1.2.4 植物内生真菌在生物防治中的应用

1.2.5 油菜中内生真菌的研究概况

1.3 毛壳菌作为生防菌的研究进展

1.3.1 毛壳菌简介

1.3.2 毛壳菌对植物病害防治的研究进展

1.3.3 毛壳菌的生防机理

1.4 植物凝集素简介

1.4.1 植物凝集素的定义和分布

1.4.2 植物凝集素的分类

1.4.3 植物凝集素的生物学功能

1.4.4 植物凝集素的抗虫机理

1.4.5 天南星科植物凝集素简介

1.4.6 植物凝集素在病虫害防治中的应用和存在问题

1.5 根癌农杆菌介导的丝状真菌遗传转化系统

1.6 研究的目的和意义

1.6.1 研究的目的

1.6.2 研究的意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 供试材料

2.1.2 所用培养基和抗生素

2.1.3 引物试剂与试剂盒

2.1.4 所用溶液

2.1.5 仪器和设备

2.2 方法

2.2.1 样品采集及油菜内生真菌的分离

2.2.2 真菌孢子形态学观察及18S rRNA鉴定

2.2.3 油菜内生毛壳菌的回接定殖及电镜观察

2.2.4 毛壳菌抑菌作用初步测定

2.2.5 表达凝集素蛋白的工程真菌(内生毛壳菌)的构建

2.2.6 SDS-PAGE电泳及Western blotting检测

2.2.7 抗虫活性检测

3 结果与分析

3.1 内生真菌的分离和初步鉴定

3.2 18S rRNA基因序列的相似性比较及系统发育树分析

3.3 毛壳菌的回接与分离结果

3.4 毛壳菌与油菜幼根互作的扫描电镜观察结果

3.5 透射电镜观察毛壳菌在油菜幼根内的定殖

3.6 毛壳菌抑菌作用初步测定结果

3.6.1 毛壳菌与病原菌平板共培养结果

3.6.2 毛壳菌与立枯丝核菌玻片对峙镜检结果

3.6.3 毛壳菌对核盘菌的抗病实验结果

3.7 表达凝集素蛋白工程真菌构建的结果与分析

3.7.1 载体的构建结果

3.7.2 根癌农杆菌转化结果

3.7.3 真菌的转化结果

3.8 抗虫活性检测结果与分析

3.8.1 转化子模拟自然条件的抗蚜虫结果分析

3.8.2 人工接种蚜虫条件下的抗虫效果分析

4 讨论

参考文献

致谢

论文发表情况