亮斑扁角水虻幼虫血淋巴抗菌活性物质的诱导、分离纯化及特性研究

摘要

传统的抗生素在生活以及医药方面的过量使用已经导致大量耐药菌株的产生，人们急切需要研发可以替代传统的抗生素的试剂，能够避免对菌类的耐药性诱导，作为新型的更加安全的药剂开发的突破。昆虫溶菌酶、抗菌肽(antibacterial peptide)，是昆虫免疫系统的重要免疫因子，是具有抗菌效果的一类小分子活性物质。它们具有广谱抗菌活性和抗病毒、抗真菌、抗寄生虫及抗肿瘤等生物活性，且不易产生抗药性。和哺乳动物不同的是，昆虫的免疫系统里没有抗体，它们在受到外界的微生物侵袭和感染的时候，昆虫的体液免疫和细胞免疫共同作用完成防御作用。此时，脂肪合成抗菌蛋白/多肽，溶菌酶等免疫因子会释放到血淋巴之中。所以相对于哺乳动物具有的获得性免疫系统(adaptive immune system)，昆虫拥有的是一种固有性免疫系统或称天然免疫(innate immune response system),而血淋巴则类似与哺乳动物的肝脏以及脂肪组织(Gillespie et al.,1997）。
　　目前应用于抗菌活性物质的研究的模式昆虫主要有双翅目中的黑腹果蝇，家蝇等以及鳞翅目中的家蚕等。亮斑扁角水虻（black soldier fly, Hermetia illucens）是一种重要的资源虫（喻国辉等，2009），在利用亮斑扁角水虻对鸡粪和猪粪的转化研究证明亮斑扁角水虻在畜禽粪便的资源化应用方面有重要的应用潜力作用（Sheppard et al.,1994; Newton et al.,2005），更重要的是是已有研究证明水虻能够在这样有大量病原微生物的环境里能够有效地抑制病原细菌的繁殖(Erickson et al.2004; liu qiaolin et al.2008)。这些研究结果预示着水虻体内很可能有较强的抗菌物质的表达。本文中侧重描述了我们对水虻幼虫血淋巴抗菌活性物质分离纯化的初步研究。利用细菌针刺等诱导方法处理水虻幼虫，比较不同诱导方法处理后，水虻幼虫血淋巴初提液的抗菌效果以及幼虫存活率，并比较水虻在不同生长时期的血淋巴抑菌效果。用离子交换层析，凝胶过滤层析法和高效液相法对诱导后的血淋巴初提液逐步进行分离纯化，得到几个具有抑菌活性的成分。Tricine-SDS-PAGE分析这些抑菌活性成分含有的蛋白分子量大都在20KD之下.通过原位自显影检测活性蛋白条带的分子量大小并进行MALTI-TOF/MS指纹图谱分析。并在Erickson等（2004）以及刘巧林（2008）的基础上采用不同的病原菌菌株作为待测菌，检验在猪粪中生长的亮斑扁角水虻幼虫是否对其中病原菌的生长产生抑制作用。
　　总结实验获得了以下主要结果（1）末龄水虻幼虫血淋巴的诱导效果最好，产生活性物质抑菌效果最佳；（2）分离纯化2个具有抗菌活性的组分，经质谱鉴定，一个为与溶菌酶有一定同源性的多肽，分子量在15KD左右，但功能未知具有进一步研究的价值，另一个分子量在10KD左右，但与现有蛋白库对比匹配较低,有可能为某种新的蛋白,但究竟否为新的抗菌肽类物质,仍有待进一步研究；（3）水虻幼虫在猪粪中生长的同时对其中的病原菌的生长产生一定的抑制作用。目前来说，这是首次对水虻的体内免疫抗菌物质进行的相关研究，这些研究为今后进一步对水虻抗菌物质的纯化以及蛋白测序提供了完备的基础，为开发利用水虻这种新型的资源昆虫提供了有用的参考,为深入研究有效处理畜禽粪便中病原微生物的方法奠定了工作基础。

目录

声明

第一章 前言

1.1昆虫免疫系统及抗菌活性物质的研究状况

1.1.1昆虫免疫系统的研究

1.1.2昆虫主要免疫活性因子溶菌酶的研究现状

1.1.3昆虫主要免疫活性因子抗菌肽的研究状况

1.1.4昆虫其它重要免疫活性因子

1.2亮斑扁角水虻的研究和应用现况

1.2.1亮斑扁角水虻的生物学特征

1.2.2 亮斑扁角水虻的人工饲养

1.2.3亮斑扁角水虻的饲料价值

1.2.4亮斑扁角水虻用于转化处理有机垃圾及废弃物

1.3亮斑扁角水虻抗菌物质的研究

1.4本课题的研究目的及意义

第二章材料与方法

2.1材料

2.1.1实验菌株

2.1.2实验用亮斑扁角水虻

2.1.3试剂

2.1.4设备

2.1.5培养基

2.2方法

2.2.1水虻虫体抗菌物质的诱导

2.2.2水虻血淋巴粗提液的制备

2.2.3抗菌活性物质分子量大小的初步确定

2.2.4 Tris-Tricine-PAGE

2.2.5阳离子型交换层析柱CM-Sepharose

2.2.6Sephadex-G50葡聚糖凝胶过滤层析

2.2.7反相液相色谱Reversed-HPLC进一步分离分析活性组分

2.2.8琼脂糖弥散抗菌实验(Radial diffusion assay)

2.2.9平板计数法(colony counting assay)检测抑菌活性

2.2.10原位自显影技术(Bioautography)

2.2.11 MALDI-TOF/MS分析

2.2.12猪粪的收集与预处理

2.2.13在猪粪中进行试验的水虻的处理

2.2.14接种至猪粪中待测细菌菌液及相应培养基的制备

2.2.15猪粪中对细菌生长抑制效果的测定

2.2.16粪便湿度测定

2.2.17数据分析与处理

第三章结果与分析

3.1不同免疫诱导方法结果比较

3.2血淋巴粗提物抑菌活性分析

3.3 Tricine-SDS-PAGE电泳观察诱导前后血淋巴蛋白表达差异

3.4血淋巴抗菌物质的纯化

3.5纯化组分原位自显影

3.6对Reverse-HPLC纯化所得成分进行平板计数法检测抑菌活性

3.7水虻幼虫血淋巴纯化分离过程中所得样品蛋白浓度

3.8 MALDI-TOF/MS指纹图谱

3.9水虻幼虫在猪粪中对三种病原细菌生长的影响

3.9.1水虻幼虫在猪粪中对金黄色葡萄球菌的生长影响情况

3.9.2水虻幼虫在猪粪中对沙门肠炎杆菌的生长影响情况

3.9.3水虻幼虫在猪粪中对大肠杆菌的生长影响情况

3.10总结

第四章讨论

参考文献

致谢