小麦根渍水形成通气组织过程中细胞壁降解与Ca相关研究

摘要

湿害在我国长江中下游麦区极为常见。湿害胁迫下植物根皮层细胞发生程序化死亡(programmed cell death,PCD)形成通气组织，但是以孕穗期小麦为材料的研究较少。本研究以孕穗期小麦(Triticum aestivumL。Huamai8)为材料进行渍水处理。试验运用常规电镜技术观察通气组织形成过程中细胞壁超微结构变化；运用TUNEL、琼脂糖凝胶电泳等方法检测小麦次生根中皮层细胞的PCD；运用Ca2+荧光染料检测根皮层中Ca2+的分布和积累；运用超微细胞化学的方法定位观察皮层细胞内Ca2+,Ca2+-ATPase和纤维素酶。实验结果如下：
　　 1.透射电子显微镜观察发现小麦根中皮层细胞壁先由靠近细胞质的初生壁开始降解，然后是胞间层。不淹水根皮层细胞结构完整并且排列紧密，淹水12h中皮层细胞壁依然完整，24h细胞壁明显变薄，48h形成发达的通气组织，皮层呈现辐射状。纤维素酶超微细胞化学定位发现根皮层细胞壁上的纤维素酶活性在淹水8h后很高，24h纤维素酶活性依然很高并且在皮层细胞壁上形成很多降解位点，48h皮层细胞壁上纤维素酶活性降低。
　　 2.小麦次生根中皮层细胞在淹水过程中选择性的发生PCD形成通气组织，有TUNEL阳性细胞核的出现。TUNEL阳性核比率经历了由低到高再到低的动态变化过程。DNAladdering条带显示淹水24h后在180bp处明显变亮，淹水96h和120h发现整个条带都不再清晰。电镜观察还发现染色质凝集、细胞壁呈现电子透明等现象，这些特征都证明小麦根中皮层细胞发生了PCD。
　　 3.不淹水的根皮层细胞壁上Ca2+荧光较弱且均匀分布，淹水后期Ca2+荧光集中在中柱、内皮层和存活做为通气组织支架的细胞壁上。Ca2+超微细胞化学定位发现淹水4h时Ca2+沉淀颗粒在一些中皮层细胞的细胞膜、液泡膜和一些囊泡上迅速增加；12h皮层细胞的细胞壁、线粒体、液泡膜和胞间隙内都有大量Ca2+沉淀颗粒；24h细胞内容物降解，Ca2+沉淀颗粒减少；观察还发现相邻皮层细胞之间的Ca2+沉淀数量存在明显差异。Ca2+-ATPase超微细胞化学定位发现在淹水8h后Ca2+-ATPase沉淀颗粒数量在一些中皮层细胞的胞间隙、质膜和液泡膜上显著增多，淹水24h后在质膜、液泡膜和细胞壁上的Ca2+-ATPase沉淀颗粒依然很多，48h后降低；观察同样发现相邻皮层细胞之间的Ca2+-ATPase沉淀颗粒数量存在明显差异。
　　 以上结果表明淹水诱导了孕穗期小麦根皮层细胞选择性死亡形成通气组织。TUNEL、琼脂糖凝胶电泳实验证明淹水诱导的小麦根皮层细胞死亡是细胞程序化死亡。Ca2+作为一种信号物质在细胞选择性死亡过程中发挥了重要作用，高浓度的Ca2+通过调节胞间连丝的闭合导致皮层细胞形成共质体分区进而导致皮层细胞的选择性死亡。小麦根皮层细胞内Ca2+、Ca2+-ATPase和纤维素酶呈动态分布并且与细胞壁的降解相关联；Ca2+和Ca2+-ATPase之间是一种反馈调节的关系。

目录

文摘

英文文摘

缩略语表

1 前言

1.1 通气组织的功能与分类

1.1.1 通气组织的功能

1.1.2 通气组织的分类

1.2 编程性细胞死亡的检测与特征

1.2.1 编程性细胞死亡的检测方法

1.2.2 编程性细胞死亡的特征

1.3 溶生性通气组织形成的信号通路

1.3.1 乙烯

1.3.2 活性氧

1.3.3 Ca2+

1.3.4 Ca2+-ATPase

1.3.5 钙调素

1.3.6 溶生性通气组织形成过程中细胞壁降解相关酶

1.4 作物渍水胁迫下根形成通气组织研究进展

1.5 本研究的目的

2 材料与方法

2.1 材料培养、处理与取材

2.2 通气组织显微结构观察

2.3 小麦次生根中皮层细胞壁超微结构观察

2.4 小麦次生根纤维素酶超微细胞化学定位

2.5 小麦次生根TUNEL实验

2.6 小麦次生根DNA laddering

2.7 小麦次生根Ca2+荧光观察

2.8 小麦次生根中皮层Ca2+超微细胞化学定位

2.9 小麦次生根中皮层Ca2+-ATPase超微细胞化学定位

3 结果与分析

3.1 小麦次生根通气组织显微结构

3.2 小麦次生根中皮层细胞壁超微结构观察

3.3 小麦次生根纤维素酶超微细胞化学定位

3.4 小麦次生根TUNEL实验

3.5 小麦次生根DNA laddering

3.6 小麦次生根Ca2+荧光观察

3.7 小麦次生根中皮层Ca2+超微细胞化学定位

3.8 小麦次生根中皮层Ca2+-ATPase超微细胞化学定位

4 讨论

4.1 小麦根皮层溶生性通气组织的结构特征

4.2 通气组织形成过程中细胞壁的降解与纤维素酶的关系

4.3 小麦根皮层PCD过程中DNA断裂的检测

4.3.1 TUNEL检测方法的选择

4.3.2 TUNEL实验的局限

4.3.3 通过TUNEL比较孕穗期和幼苗期小麦次生根PCD的差异

4.3.4 小麦次生根细胞核内DNA的断裂

4.4 Ca2+在小麦次生根中皮层细胞选择性死亡中的作用

4.5 Ca2+和Ca2+-ATPase的时空分布与细胞壁降解的关系

4.6 后续研究的可能方向

4.6.1 小麦次生根中柱有很多未解之谜

4.6.2 小麦次生根细胞壁降解相关酶类

参考文献

附录1 论文图版

附录2 在读期间发表和拟发表的论文

致谢