猪蓝耳病病毒受体硫酸乙酰肝素相关基因的分离、定位及其功能的初步研究

摘要

疾病每年给畜牧业造成了巨大的经济损失，制约了我国养猪业的迅速发展。所以对提高猪抗病能力和抗病育种的研究有着不可估计的价值。2006年被称为“高热病”的猪高致病性蓝耳病在中国大面积暴发，疫情波及10多个省（市、区）。这场疫情对大约212万头猪造成影响并导致至少40万头猪死亡。蓝耳病已成为制约养猪业健康发展的头号传染病。蓝耳病病毒是由受体介导进入宿主细胞的,目前已鉴定出的受体有四个,分别是：硫酸乙酰肝素（Heparan sulfate，HS）、唾液酸黏附素（sialoadhesin, SN），CD151和CD163。其中HS能将游离于细胞膜表面的病毒吸附并固定于细胞膜上，起到吸附病毒的作用。该过程决定了病毒的感染量，在病毒进入细胞的过程中起到至关重要的作用。HS在机体内是以一种蛋白多糖（ Heparan sulfate proteoglycan，HSPG）的形式存在并起作用的，HSPG是由核心蛋白和HS侧链组成的。在机体内合成 HS的过程中有许多酶调控，其中经实验验证较为重要的一个关键酶是N-脱乙酰基酶/N-硫转移酶4（N-deacetylase/N-sulfotransferase-4，NDST4），而在机体内HS降解过程中只有唯一一个内源性的切割酶，即类肝素酶（heparanase， HPSE）。所以本研究以在蓝耳病病毒进入宿主细胞过程中起吸附作用的受体 HS及其相关基因为研究对象进行了基因的分离，定位，组织表达规律及在不同品种间的基因差异表达和SNP筛查及其与免疫性状间的关联分析。得到的主要结果如下：
　　1．运用比较基因组学和生物信息学的方法，设计引物以通城猪和大白猪的肺泡巨噬细胞为模版，分离鉴定得到了猪SDC2和HPSE两个基因并分别获得了1100bp和1735bp的完整CDS及部分非编码区序列。对这两个基因的CDS序列进行生物信息学分析，推导出其氨基酸序列并在 SDC2基因上预测到了4.1m结构域（putative band4.1 homologues' binding motif）。
　　2．运用辐射杂种板技术对猪SDC2，PERLECAN和HPSE基因进行了染色体精细定位，分别将这三个基因定位于猪的4号，6号和8号染色体上，并依次与微卫星SW362，SW709和 SW1980紧密连锁，LOD值分别为5.23，7.98和3.43。
　　3．运用半定量RT-PCR的方法，以成年通城猪的心、肝、脾、肺、肾、胃、肌肉、脂肪和淋巴九个组织作为研究材料，对猪SDC2，PERLECAN和HPSE基因的组织表达规律进行了研究。结果发现，SDC2基因在所有的组织中都表达但在肝脏中表达量较低，PERLECAN基因除了在淋巴中不表达，在其它组织中均表达。HPSE基因则仅在肝脏、肺和小肠中表达。
　　4．运用Affymetrix猪基因组芯片对通城及大白猪人工感染PRRSV前后肺泡巨噬细胞的基因表达水平进行检测分析筛选得到猪HPSE和NDST4基因的表达呈显著差异。NDST4在通城猪感染后表达量是感染前的0.4863倍；HPSE在感染前大白猪中的表达量比感染前的通城猪高4.114倍，经定量QPCR验证，结果与芯片中所反应的趋势一致。
　　5．运用PCR-RFLP和测序的方法对猪SDC2，PERLECAN和HPSE三个基因在我室与湖北天种畜牧股份有限公司合作组建的试验群体中进行了SNP扫描与性状关联分析。结果表明：SDC2基因在5’UTR的BanⅡ多态位点与红细胞平均体积(MCV)和血红蛋白(HGB)呈极显著相关（P<0.01），在第三外显子上的 HpyCH4Ⅳ多态位点与与红细胞计数（RBC）和红细胞压积(HCT)呈显著相关（P<0.05），第三外显子上的BstXI多态位点未发现与任何性状呈显著相关。PERLECAN基因在第26内含子上的Sau96Ⅰ多态位点与平均红细胞血红蛋白含量(MCH)呈显著相关（P<0.05）。HPSE基因在第5外显子上的AluⅠ多态位点与红细胞计数(RBC)、白细胞计数（WBC）、血红蛋白(HGB)和红细胞压积(HCT)呈显著相关（P<0.05）。
　　以上研究结果可为不同品种的猪对蓝耳病抗病性差异的遗传基础的研究提供线索，同时为猪抗病育种候选基因的研究提供素材。

目录

声明

1 文献综述

1.1 研究问题的由来

1.2 猪蓝耳病的研究进展

1.3 蓝耳病病毒受体——硫酸乙酰肝素（Hs）及其多糖复合物的结构及功能

1.4硫酸乙酰肝素在动物体内的代谢过程

1.5本研究涉及基因的研究进展

1.6本研究的目的和意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.2 方法

3 结果

3.1 猪SDC2和HPSE基因的分离及序列分析

3.2猪SDC2﹑PERLECAN和HPSE的染色体定位结果

3.3猪SDC2﹑PERLECAN和HPSE的组织表达谱分析

3.4 目的基因在芯片中的结果及QPCR验证

3.5三个基因的SNP检测及其与性状的关联分析

4 讨论

4.1 关于利用比较基因组学和基因组数据库来分离新基因

4.2 关于SDC2的蛋白结构预测

4.3关于猪SDC2,PERLECAN和HPSE这三个基因的染色体定位

4.4关于基因表达谱的分析

4.5关于基因的SNP扫描与性状关联分析

4.6 关于HS合成酶基因NDST4和降解酶基因HPSE的表达量与HS的关系

5 小结

5.1本研究获得的结果

5.2 本研究的创新点与特色

5.3本研究的不足之处及进一步值得研究的工作

参考文献

附录1 缩略词表

附录2 猪SDC2基因部分cDNA序列

附录3 猪HPSE基因部分cDNA序列

致谢