流行性造血器官坏死病毒ELISA检测方法的初步建立

摘要

流行性造血器官坏死病（Epizootic hematopoietic necrosis，EHN）是由EHN病毒引起的红鳍鲈鱼和虹鳟鱼的一种全身性病毒性疾病。随着我国水产业迅速发展，水生动物疫病日益增多，特别是由EHN等病毒引起的流行性疫病危害更为严重。本研究针对我国水生动物疫病现状，以本实验室引进和保存的EHN病毒为材料，进行了该病毒的实验室培养、鉴定及其某些生物学特性研究，并在此基础上，克隆表达了EHNV的主要衣壳蛋白(MCP)，初步建立了基于MCP蛋白的EHN病毒感染的ELISA检测方法，取得了如下结果：
　　 1.EHN病毒的增殖和鉴定利用对流行性造血器官坏死病毒(EHNV)敏感的大鳞大麻哈鱼胚胎细胞系(CHSE)增殖病毒；测定了病毒毒力和培养液中的病毒滴度；采用蔗糖密度梯度离心法对收获的病毒进行了纯化；通过SDS-PAGE和Westernblotting方法对纯化病毒进行了病毒组份鉴定和免疫学活性分析，为后续EHNV高免血清的制备及ELISA检测方法的建立奠定了基础。
　　 参照GenBank已发表的流行性造血器官坏死病毒(EHNV)MCP基因序列，以本实验室保存的EHNV毒株为实验材料，提取DNA，将用PCR方法扩增得到的MCP基因克隆到pMD18-T载体上，对重组质粒进行酶切鉴定和序列测定。结果表明，扩增片段的长度为1392bp，所测得的基因序列与GenBank上所报道的EHNV的MCP序列同源性在99％以上。将重组基因插入原核表达载体pET-32a，成功构建了重组表达质粒ET-32a，并在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了高效表达；对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析，结果与预期蛋白大小一致，Westernblotting检测表明，该表达蛋白具有良好的免疫学活性。
　　 3.EHN病毒ELISA-MCP检测方法的初步建立用纯化的EHNV免疫新西兰大耳白兔和Balb/c小鼠，制备高免血清。以亲和纯化的兔抗EHNVIgG为包被抗体，鼠抗EHNVIgG为第二抗体，建立了检测EHNV的双抗体夹心ELISA方法，并对影响ELISA反应的各种条件进行了优化。结果表明，兔抗EHNVIgG的最佳包被浓度为0.5μg/mL，鼠抗EHNV血清的最适工作浓度约为1：12800；与已知流行性造血器官坏死病标准病毒呈强阳性反应，与已知的阴性样品及其它一些鱼类病毒无交叉反应。该方法的建立，为我国水生动物EHN病毒的常规检测提供了技术手段。

目录

文摘

英文文摘

缩略词表( Abbreviation)

第一章 文献综述

1 文献综述

1.1 流行性器官坏死病概况

第二章 流行性造血器官坏死病毒的培养和验证

1 研究目的意义

2 材料方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

3 结果与分析

3.1 病毒的验证

4 讨论

4.1 细胞培养

4.2 病毒增殖纯化

4.3 病毒验证

5 结论

第三章 流行性造血器官坏死病毒MCP蛋白的原核表达与鉴定

1 研究目的与意义

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

3 结果与分析

3.1 MCP基因的扩增结果

3.2 MCP基因的克隆与鉴定

3.3 pT-MCP基因的序列测定与分析

3.4 重组质粒的pET-32a-MCP的构建和鉴定

3.5 重组蛋白表达产物的SDS-PAGE分析结果

3.6 重组蛋白表达产物的Westernblotting分析结果

4 讨论

4.1 EHNVMCP基因的扩增

4.2 EHNVMCP基因表达及其包涵体的提取

5 结论

第四章 流行性造血器官坏死病毒抗血清的研制

1 研究目的意义

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

3 结果与分析

3.1 抗原最佳包被浓度的确定（与兔抗EHNV血清反应）

3.2 测定兔血清效价

3.3 抗原最佳包被浓度的确定（与鼠抗EHNV血清反应）

3.4 测定鼠血清效价

3.5 亲和纯化兔抗EHNVIgG

4 讨论

4.1 抗血清的制备

4.2 测血清效价

4.3 亲和纯化

5 结论

第五章 流行性造血器官坏死病毒ELISA检测方法的初步建立

1 研究目的意义

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

3 结果与分析

3.1 包被抗体(Ab1)和检测抗体(Ab2)最佳工作浓度测定

3.2 临界点的确定

3.3 特异性交叉试验

3.4 特异性阻断试验

4 讨论

5 结论

参考文献

致谢