猪Ⅲ型干扰素IFN-λ1的克隆、表达和抗病毒活性研究

摘要

干扰素（interferon,IFN）是一类具有抗肿瘤、广谱抗病毒和增强免疫功能的细胞因子。根据其生物学活性和抗原活性的不同分为三类：IFN-a、IFN-β、IFN-γ，并将具有共同表面受体的IFN-a和IFN-β归属于Ⅰ型干扰素；而与IFN-a、IFN-β具有不同表面受体的IFN-γ归属于Ⅱ型干扰素。Ⅲ型干扰素则是2003年首次报道的一类不同于Ⅰ型干扰素和Ⅱ型干扰素的新家族，又称为λ干扰素，包括IFN-λ1、IFN-λ2、IFN-λ3，由于其基因结构与IL-10相似，所以又称为IL-29、IL-28A、IL-28B。这种新型的干扰素和其他的干扰素一样具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等生物学活性。Ⅰ型和Ⅱ型干扰素已被广泛应用于人医临床多种疾病的治疗，而对于Ⅲ型干扰素的研究相对滞后，因此，开展对Ⅲ型干扰素研究无论是对动物传染病的控制还是对人医疾病的治疗都将起到一定的促进作用。鉴于此，本研究以猪Ⅲ型干扰素IFN-λ1为研究对象，开展了其对猪繁殖与呼吸综合征病毒抗病毒活性的研究，主要研究内容包括：
　　 1.猪Ⅲ型干扰素IFN-λ1基因的克隆与序列分析以猪外周血淋巴细胞中提取的总RNA为模板，PoIFN-λ1-F2、PoIFN-λ1-R2兼并引物为上下游引物，RT-PCR扩增获得PoIFN-λ1基因，片段大小为576bp，序列分析发现与GenBank登录的人IFN-λ1的核苷酸序列同源性为76.12％，氨基酸序列同源性为69.15％。SignalP3.0Server软件分析PoIFN-λ1的氨基酸序列，发现前19个氨基酸构成了PoIFN-λ1的信号肽。
　　 2.猪Ⅲ型干扰素IFN-λ1的原核表达设计引物扩增去除信号肽的PoIFN-λ1片段，EcoRⅠ、XhoⅠ酶切后插入原核表达载体pET-28a(+)，获得原核表达质粒pET-PoIFN-λ1，转化宿主菌BL21,IPTG诱导，SDS-PAGE分析证实PoIFN-λ1与His融合表达，并主要以不溶性包涵体形式存在，大小约为23kDa。将表达产物变性、复性、透析和纯化处理后，利用MDBKNSV（水泡性口炎病毒）微量细胞病变抑制法测定其抗病毒活性，结果原核表达产物的生物活性为1.8×103U/mg。
　　 3.猪Ⅲ型干扰素IFN-λ1多克隆抗体的制备以原核表达产物为抗原免疫新西兰兔制备了兔抗PoIFN-λ1的多克隆抗体，ELISA检测血清抗体效价为1:320。将此血清和抗His单克隆抗体分别作为一抗，通过Westernblot检测PoIFN-λ1的原核表达产物，结果均在约23kDa处出现特异性反应带，说明血清中存在PoIFN-λ1的抗体，同时也说明PoIFN-λ1与His的融合表达成功，并具有反应原性。
　　 4.猪Ⅲ型干扰素IFN-λ1的真核表达构建真核表达质粒pcDNA-PoIFN-λ1，转染PK-15细胞，于转染后24h、48h、72h收集上清，以PoIFN-λ1的多克隆抗体为一抗，Westernblot检测发现转染后不同时间PoIFN-λ1均有表达，但以转染后48h的表达量最高。进一步以MDBK/VSV微量细胞病变抑制法测定转染后48h上清的抗病毒活性，生物活性为2.3×103U/mL。
　　 5.猪Ⅲ型干扰素IFN-λ1对PRRSV和PRV的抑制作用PoIFN-λ1原核表达产物以50U/mL、100U/mL、150U/mL、200U/mL预处理SJPL细胞24h，分别接种PRRSVCH-1a、WuH3毒株，于接种后12h、24h、36h、48h收集细胞悬液，Real-TimePCR和TCID50检测病毒的增殖情况，结果发现PoIFN-λ1能明显抑制两种不同毒株mRNA的表达和病毒增殖的滴度，并且对CH-1a株的抑制效果优于WuH3株，但对两种毒株的抑制均呈剂量和时间的依赖性。
　　 为了研究PoIFN-λ1对PRV增殖的影响，以PoIFN-λ1原核表达产物处理PK-15细胞，接种PRV进行空斑检测，结果随着PoIFN-λ1剂量的增加PRV形成的空斑数逐渐减少，说明PoIFN-λ1也能抑制PRV的增殖，并呈剂量依赖性。

目录

文摘

英文文摘

缩略语表

第1章 文献综述

1.1 干扰素简介

1.2 Ⅲ型干扰素的分子结构和编码蛋白

1.3 Ⅲ型干扰素的产生和调节

1.4 Ⅲ型扰素的受体

1.5 Ⅲ型扰素的受体和信号转导

1.6 Ⅲ型扰素的生物功能

1.7 重组蛋白表达系统简述

第2章 研究目的和意义

第3章 材料与方法

3.1 试验材料

3.1.1 毒株、细胞与菌株

3.1.2 载体与质粒

3.1.3 工具酶及主要试剂

3.1.4 培养基与抗生素及其配制

3.1.5 主要缓冲液与相关试剂及其配制

3.2 试验方法

3.2.1 猪外周血单核细胞(PBMC)的分离及诱导培养

3.2.2 猪PBMC总RNA的提取

3.2.3 RT-PCR扩增PoIFN-λ1

3.2.4 RT-PCR产物或酶切产物的电泳检测

3.2.5 PCR产物或酶切产物回收与纯化

3.2.6 外源DNA片段与克隆质粒载体的连接反应

3.2.7 大肠杆菌感受态细胞的制备（氯化钙法）

3.2.8 连接产物的转化

3.2.9 质粒的制备与鉴定

3.2.10 PoIFN-λ1的原核表达

3.2.11 PoIFN-λ1多克隆抗体的制备

3.2.12 PoIFN-λ1的真核表达

3.2.13 表达产物的Western blot检测

3.2.14 ELISA试验

3.2.15 半数细胞培养物感染量(TCID50)的测定

3.2.16 PoIFN-λ1生物学活性的测定

3.2.17 PoIFN-λ1抗PRRSV、PRV作用

第4章 结果与分析

4.1 PoIFN-λ1的扩增及序列分析

4.1.1 PoIFN-λ1基因的扩增

4.1.2 PoIFNλ1的核苷酸序列和氨基酸序列

4.1.3 PoIFN-λ1的氨基酸进化树分析

4.2 PoIFN-λ1原核表达

4.2.1 PoIFN-λ1原核表达质粒的构建

4.2.2 融合蛋白的诱导表达

4.2.3 融合蛋白的可溶性分析

4.2.4 融合蛋白的Western blot检测及抗病毒活性测定

4.2.5 PoIFN-λ1多克隆抗体的制备

4.3 PoIFN-λ1真核表达

4.3.1 PoIFN-λ1真核表达质粒的构建

4.3.2 PoIFN-λ1真核表达产物的Western blot检测及抗病毒活性测定

4.4 PoIFN-λ1对PRRSV和PRV的抑制作用

4.4.1 PoIFN-λ1对PRRSV CH-1a增殖的影响

4.4.2 PoIFN-λ1对PRRSV WuH3增殖的影响

4.4.3 PoIFN-λ1对PRV Ea株增殖的影响

第5章 讨论与结论

5.1 讨论

5.1.1 猪Ⅲ型干扰素IFN-λ1的克隆及序列分析

5.1.2 猪Ⅲ型干扰素IFN-λ1的原核表达

5.1.3 猪Ⅲ型干扰素IFN-λ1的真核表达

5.1.4 猪Ⅲ型干扰素IFN-λ1对PRRSV和PRV抑制作用

5.2 结论

参考文献

致谢