棉花体细胞胚胎发生相关基因GhHmgB3的克隆及功能分析

摘要

棉花是一种重要的经济作物,对其体细胞胚胎发生过程的研究是现代生物技术应用于遗传育种的基础。同时,作为细胞全能性的经典例证,植物体细胞胚胎发生又是生命研究的一个重要模型。深入了解该过程的发生机制、优化棉花的再生体系具有重要的研究和应用价值。
　　 本研究以发掘控制体细胞胚胎发生调控的关键基因为目的,克隆了HmgB家族的四个成员,通过对该家族的胚性组织特异表达成员GhHmgB3功能的深入研究,以及相关基因的表达模式的系统分析,对体细胞胚胎发生这一独特的生命过程的调控机制进行了探讨。研究的主要结果如下:
　　 1.用BD SMART RACE技术设计引物进行RACE扩增,克隆了HmgB家族的4个成员。通过Real-time PCR分析各个家族成员在根、茎、叶、合子胚、体细胞胚胎发育的各个时期的表达模式。参考小鼠HmgB基因的命名方式,把两个组成型表达的基因命名为GhHmgB1(HM449081)和GhHmgB2(HM449078)；在胚性组织特异表达的基因命名为GhHmgB3(HM449079)；在非胚性组织表达的基因命名为GhHmgB4(HM449080)。并选定GhHmgB3做下游的功能分析。
　　 2.用生物信息学工具Blast分析GhHmgB3的结构域,发现该基因包含一个Hmg box结构域,与拟南芥HmgB3的同源度最高。结合Real-time PCR、Northernblotting对该基因在根、茎、叶、合子胚发育以及体细胞胚胎发育的各个时期的表达模式进行分析,发现该基因在合子胚的子叶胚时期、体细胞胚胎发育的整个阶段优势表达。
　　 3.选取一段包含GhHmgB3保守结构域和3’特异区(207—391)的序列,用Clontech的Gateway技术构建RNAi载体。用农杆菌介导的转化法分别转化陆地棉Coker201的下胚轴和胚性愈伤,筛选并鉴定多个转基因胚性愈伤系。
　　 4.全程观察、记录转基因材料在体细胞脱分化和胚性细胞分化的各个阶段的表型。以转空载体的材料作为对照,GhHmgB3抑制表达的体细胞脱分化的速度和程度都优于对照,但是最终它们无法分化为胚性细胞。另一方面,GhHmgB3抑制表达的胚性愈伤材料的增殖和分化能力优于对照,但是无法长成正常的植株。
　　 5.用Solexa sequencing技术,发掘转基因干涉胚性愈伤和对照之间差异表达的基因。通过对差异表达基因的gene ontology(GO)和Kyoto Encyclopedia ofGenes and Genomes(KEGG)分析,在棉花的体细胞胚胎发育过程中存在一系列β-catenin相关的途径控制着体细胞胚的增殖、生长和分化。系统分析一系列相关基因的表达量变化,并结合Real-time PCR的验证,推断抑制GhHmgB3激活了β—catenin的表达,从而促进了增殖。β-catenin的异常表达激活了stress induced-MAPK/p38途径,减少β-catenin和TCF/LEF结合,导致核内β-catenin/TCF途径被抑制。因为β-catenin/TCF和β-catenin/cadherin的竞争关系,更多的β-catenin和细胞骨架结合,促进了细胞的分化。
　　 6.用5-氟脲嘧啶处理细胞,进行细胞周期分析,结果显示:GhHmgB3干涉的胚性愈伤的细胞周期进程要短于对照。同时用MTS assay酶活检测的方法检测细胞的增殖能力,结果显示转基因材料的增殖能力要强于对照。
　　 7.结合β-catenin/TCF pathway下游基因以及MAPK pathway代表基因在干涉材料和对照中的表达模式,取状态均一胚性愈伤细胞进行正常状态下细胞周期分析,结果显示GhHmgB3表达受到抑制的细胞更多地停留在G1期,β-catenin的核内信号受到了抑制。
　　 8.分析β-catenin和细胞骨架相关基因的表达模式,Real-time PCR结果显示Actin10在干涉材料中的表达量高于对照。结合体胚标记基因SERK和Solexa结果中钙离子相关基因(CAM和CDPK)的表达模式推断:β-catenin在细胞质中信号的激活提高了体细胞胚胎的分化能力。取状态均一的悬浮系细胞进行透射电镜观察,结果显示,转基因的干涉材料分化程度要高于对照。
　　 综上所述,GhHmgB3在棉花的体细胞胚胎发育过程中起重要的调节作用。