日本结缕草IPT基因遗传转化及野牛草实生群体内遗传多样性研究

摘要

日本结缕草和野牛草都是适应我国国情的优质暖季性草坪草。在进一步发展其优异的抗逆性同时,创造出具草坪优良性状特别是绿色期延长的新遗传种质是重要的育种目标。本研究建立了愈伤组织长期继代并具有高频再生能力的培养体系,分析了长期继代再生植株群体内存在的变异；并进一步利用该再生体系,以农杆菌介导的方法将IPT基因转入日本结缕草。此外,本研究针对草坪草容易变异的特征,对野牛草实生群体进行了形态与遗传物质多样性研究,结果如下:
　　 1、日本结缕草IPT基因的遗传转化:
　　 (1)以成熟胚为外植体诱导的愈伤组织长期继代高频再生体系的建立。诱导的胚性愈伤组织继代间隔时间为30d,在增加0.5×MS基本培养基Fe盐的继代培养基上,继代1-2次可以使愈伤组织的颗粒性增强。长期继代的愈伤组织分化率降低到0％,但在继代培养基中添加14mg/L CuSO4预培养后,分化率可以提高到97％。继代30个月的愈伤组织切片观察,与新鲜愈伤组织相似,体胚发生和器官发生再生途径同时存在。
　　 (2)长期培养愈伤组织再生植株的体细胞变异。以一粒种子诱导的愈伤组织增殖并长期继代再生的日本结缕草植株为材料研究发现,其在长期继代培养中容易发生变异。形态指标中匍匐茎数量和长度以及绿色期变异较大,有利于优异种质的筛选；利用ISSR和RAPD分子标记检测继代培养再生植株的遗传多样性,多态性位点数分别为83.6％和72.4％,样品特异性位点比例分别为15.1％、3.4％,显示组织培养中体细胞变异比率较高。两种分子标记遗传距离矩阵相关性分析,发现两者没有显著相关性r=0.2397(P≦0.05),表明两种不同标记都能检测出再生群体的遗传多样性,但ISSR能扩增出更多的特异性带,在本实验中对日本结缕草的体细胞变异分析,ISSR比RAPD更合适。
　　 (3)农杆菌介导的IPT基因的遗传转化。通过农杆菌介导法,成功地将特异抑制衰老的自我调控嵌合基因PSAG12∷IPT导入到日本结缕草的胚性愈伤组织,经筛选得到45株抗性植株,经田间鉴定转基因株系的枯黄期较野生型推后了15-71d,绿色期有了极大的改善,证明通过PSAG12∷IPT表达的调控增加结缕草体内的细胞分裂素含量以延长其绿色期是确实可行。PCR检测及Southern杂交,证实IPT已整合到结缕草的基因组中且得到表达,PCR检测阳性率达到51.1％。
　　 2、野牛草实生群体多样性研究:
　　 从102株实生群体中通过目测形态筛选出20株有明显差异的单株,通过表型性状调查和ISSR分子标记两种方法对野牛草实生群体的多样性进行分析,筛选出7条适合野牛草的ISSR引物,共扩增出89条带,多态性条带74条(83.14％1)。单株间相似系数在0.58～0.82之间,遗传距离分布于0.17—0.42之间。表明野牛草实生群体内的遗传多样性较高,说明实生苗群体内可以采用单株选择法选育优良无性系。ISSR标记聚类结果与形态特征没有显著的相关关系,显示野牛草杂交亲本选择时不仅要考虑表型的差异,也要参考分子标记的差异。