苏云金芽胞杆菌中Cry51Aa1晶体形成特点及新杀虫基因cry65Aa1的克隆

摘要

苏云金芽胞杆菌产生的杀虫晶体蛋白可以通过各种机制的调控从而高效表达，例如：形成伴胞晶体；并且因为其高产杀虫晶体蛋白，在农、林害虫防治上具有较高的应用价值。本研究围绕苏云金芽胞杆菌进行了两部分的工作，即：
　　1. Cry51Aa1一级结构与晶体形成关系的研究。
　　前期工作表明从菌株F14-1中克隆得到的Cry晶体蛋白Cry51Aa1可以单独形成典型的菱形晶体，其在蛋白质大小和氨基酸组成上与普遍能形成菱形晶体的Cry1、3、5群晶体蛋白有很大的差异。本实验通过构建Cry51Aa1蛋白基因两端截短突变体和两端丙氨酸扫描突变体，研究了 Cry51Aa1一级结构与晶体形成关系，发现其晶体的形成是一种新的菱形晶体形成模式。主要研究结果如下：
　　1.1.Cry51Aa1 C-端和N-端分别截短10个氨基酸后不能形成晶体或包含体；
　　1.2. Cry51Aa1 C-端截短5个氨基酸后可以形成菱形晶体，Cry51Aa1 N-端截短5个氨基酸后不能形成菱形晶体；
　　1.3.将 Cry51Aa1两端的位于2-7位氨基酸残基每3个突变为丙氨酸，突变体2I3L4D、5L6K7S形成不规则包含体，其晶体蛋白的表达量显著降低，说明位于4、6位的极性氨基酸可能形成分子间盐键，从而在其菱形晶体形成过程中起帮助蛋白分子间契合累积形成晶体的作用，突变掉之后，晶体形态明显改变，蛋白表达量明显下降；
　　1.4.将Cry51Aa1两端的位于8-10和297-299位氨基酸残基每3个突变为丙氨酸，突变体8L9V10L和297A298P299T形成不规则包含体，其晶体蛋白的表达量基本不变，说明其氨基酸组成中的位于2、3、5、8、9、10位的脂肪族氨基酸残基由于影响蛋白分子自身的折叠，突变掉之后，晶体形态明显改变，但不影响其蛋白的表达量。
　　2.新基因cry65Aa1的克隆、表达和活性鉴定。
　　Sbt003是一株有特点的苏云金芽胞杆菌菌株，在其进行了全基因组测序的基础上，通过生物信息学的方法，从中发现了一个与具有抗癌细胞晶体蛋白(Parasporin)具有少量相似性的新型晶体蛋白基因，并通过PCR的方法克隆得到，随后对其进行了异源表达和活性鉴定。并初步研究了ORF1对其晶体形成的影响。主要研究成果如下：
　　2.1.从菌株Sbt003中克隆得到新杀虫蛋白基因cry65Aa1，其下游有一个基因orf1;Cry65Aa1(预测大小117 KDa)与Cry41Aa1有28%的相似性，为三结构域Parasporin(PS)蛋白，Cry41Aa1为Parasporin-3(PS3)；ORF1(预测大小58 KDa)与Cry21Ba1 C半段有98%相似性，Cry21Ba1为杀线虫毒素；
　　2.2.Cry65Aa1与ORF1在无晶体突变株BMB171中异源共表达形成蛋白晶体，SDS-PAGE分析其蛋白晶体带大小分别为117-和58-kDa，与预测一致；
　　2.3.Cry65Aa1单独表达不能形成晶体，其蛋白晶体的形成需要ORF1的帮助；
　　2.4.Cry65Aa1对棉铃虫有低的生长抑制作用。

目录

声明

缩略语表

第一章 文献综述

1.1 苏云金芽胞杆菌简介

1.2 苏云金芽胞杆菌Cry蛋白的发现、分类及其多样性

1.3 苏云金芽胞杆菌中Cry蛋白晶体的形成

1.3.1 苏云金芽胞杆菌Cry蛋白一级结构与晶体形成的关系

1.3.2 苏云金芽胞杆菌中辅助蛋白与Cry蛋白晶体形成的关系

1.4 苏云金芽胞杆菌中的抗癌蛋白家族Parasporin

1.4.1 Parasporin的发现

1.4.2 Parasporin的结构和特性

1.4.3 Parasporin的活性

1.5 苏云金芽胞杆菌中新cry基因的克隆策略

1.6 研究意义

第二章 Cry51Aa1晶体蛋白一级结构与晶体形成的关系

2.1材料与方法

2.1.1 菌株与质粒

2.1.2 主要培养基

2.1.3 生长条件

2.1.4 本研究中用到的寡核苷酸引物

2.1.5 试剂和仪器

2.1.6 DNA操作

2.1.7 SOE-PCR

2.1.8 重组质粒的转化及转化子的筛选鉴定

2.1.9晶体蛋白样品的制备、SDS-PAGE

2.1.11 苏云金芽胞杆菌伴胞晶体的光学显微镜观察

2.2 结果与分析

2.2.1 Cry51Aa1晶体蛋白的氨基酸序列特点

2.2.2 Cry51Aa1两端截短突变体的构建

2.2.3 Cry51Aa1两端丙氨酸扫描突变体的构建

2.2.4 Cry51Aa1两端分别截短10个氨基酸后不能形成菱形晶体

2.2.5 第300-305位氨基酸对菱形晶体的形成不是必须的

2.2.6 第2-10和297-299位氨基酸对菱形晶体形成是必须的

2.2.7 第2-4、5-7位的氨基酸突变为丙氨酸使其蛋白表达量显著降低

2.3 结论与讨论

第三章 新型杀虫晶体蛋白基因cry65Aa1的克隆

3.1材料与方法

3.1.1 菌株与质粒

3.1.2 主要培养基及生长条件

3.1.3 本研究中用到的寡核苷酸引物

3.1.4 试剂和仪器

3.1.5 供试昆虫

3.1.6 DNA操作

3.1.7 SOE-PCR

3.1.8 重组质粒的转化及转化子的筛选鉴定

3.1.9 晶体蛋白样品的制备和SDS-PAGE

3.1.10 晶体蛋白的定量

3.1.11 苏云金芽胞杆菌芽胞的计数

3.1.12 苏云金芽胞杆菌伴胞晶体的光学显微镜观察

3.1.13 苏云金芽胞杆菌伴胞晶体的扫描电子显微镜观察

3.1.14 晶体蛋白的毒力测定

3.2 结果与分析

3.2.1 cry65Aa1基因的克隆及序列分析

3.2.2 Cry65Aa1异源表达载体的构建

3.2.3 Cry65Aa1与ORF1共表达能形成蛋白晶体

3.2.4 Cry65Aa1的表达及晶体形成需要ORF1的帮助

3.2.6 Cry65Aa1的毒力测定

3.3 结论与讨论

参考文献

致谢