多基因标记辅助选择及Lbx基因家族的分子生物学研究

摘要

随着分子数量遗传学及其相关学科的发展,有关动物遗传标记辅助选择方面的研究也在不断深入。在过去的研究中,已发现黑素皮质素受体-4(Melanocortin-4Receptor,MC4R),心脏型脂肪酸结合蛋白(Heart FABP,H-FABP),瘦素(Leptin,LEP),氟烷基因(Halothane,HAL),钙蛋白酶抑制蛋白(calpastatin,CAST)和肌细胞生成素(myogenin,MyoG)等基因与胴体、肉质性状相关。我们通过PCR-RFLP分析了以上基因在DIV2系(中国瘦肉猪新品系)和7个纯种猪中的多态性分布,并在DIV2系中进行了遗传效益分析,同时研究了多基因标记同时选择的可能性。在脊椎动物中,Lbx基因(Ladybird-like genes)家族对于肌肉形成和神经发育起着重要作用。本研究对猪Lbx1和Lbx2基因进行了分离和遗传效应分析。作为重要的表观遗传学现象之一,DNA甲基化对基因的表达发挥重要的调控功能。因此,我们在肌肉组织中研究了Lbx1和Lbx2基因表达和甲基化之间的关系。并通过诱导分化C2C12细胞,研究DNA甲基化对MyoD(myogenic differentiation1),Myf5(myogenic factor5),Pax7(paired box7)和Lbx1基因表达的影响。主要试验结果如下:
　　 1.通过PCR-RFLP分析了MC4R,H-FABP,LEP,HAL,CAST和MyoG基因多态位点在DIV2系和7个纯种猪中的分布,并在DIV2系中进行了遗传效应分析,结果表明:(1)MC4R基因中的TaqⅠ酶切位点与平均背膘厚、瘦肉率显著相关(P<0.05)；(2)LEP基因中的HinfⅠ酶切位点,BB基因个体的日增重极显著高于AA基因型个体(P<0.01),AB基因个体的日增重显著高于AA基因型个体(P<0.05)；(3)H-FABP基因第二内含子的HaeⅢ酶切位点,DD基因型个体的瘦肉率显著高于dd基因型个体(P<0.05)；(4)在CAST基因.MspⅠ位点中,EE基因型个体的日增重显著高于FF基因型个体(P<0.05),EF基因型个体的日增重极显著高于FF基因型个体(P<0.01)。
　　 2.连锁不平衡分析显示:在DIV2系、大白猪、长白猪和八眉猪中,MC4R和LEP基因位点问、LEP和H-FABP基因位点间的连锁不平衡度不显著(P>0.05)；在DIV2系、大白猪、长白猪、皮特兰猪和八眉猪中,MC4R与H-FABP基因位点间的连锁不平衡度不显著(P>0.05)。这表明两个位点间是独立的,因此对其中一个位点的选择不会影响另一个位点的等位基因频率。
　　 3.采用电子克隆方法获得了两个候选基因的编码区序列:(1)Lbx1,mRNA中的CDS全长846bp,编码281个氨基酸:(2)Lbx2,mRNA.中的CDS全长591bp,编码196个氨基酸。通过比较不同物种氨基酸序列,对以上两个基因进行了系统进化树分析,发现猪Lbx1与牛、小鼠、人、犬、类人猿进化关系较近,猪Lbx2与牛、猩猩、犬进化关系较近。
　　 4.RT-PCR分析显示:猪Lbx1基因在肌肉组织中高表达；Lbx2基因在肝、肾和脾中微弱表达,但在肌肉组织中不表达。在出生后肌肉发育过程中,Lbx1基因的表达处于动态变化中,一月龄之内,表达量相对较高,在二月龄时,表达量显著下调,该变化趋势与产后肌肉组织中肌卫星细胞分化比例的变化一致,由于Lbx1基因已被证实在肌卫星细胞分化初期表达,因此我们推测该基因可能与出生后肌肉增生机制有关。在不同肌肉组织中的分析表明:猪Lbx1基因在股二头肌中的表达量显著高于在咬肌,背最长肌和半腱肌中的表达量,推测Lbx1基因的表达量与肌纤维类型并无直接关系。
　　 5.通过亚硫酸盐测序技术,在猪背最长肌中分析Lbx1和Lbx2基因启动子和外显子1的甲基化状态。发现:(1)Lbx1基因的甲基化差异区在外显子1处的CpG岛内；(2)Lbx2基因的甲基化差异区在CpG岛外的启动子区。Lbx1基因CpG岛内的高密度甲基化可能参与下调该基因在背最长肌中的表达量。
　　 6.通过对猪Lbx1基因组SNP扫描,发现2个引起酶切位点改变的SNP:g.752A>G和g-1559C>G。在大白×梅山F2代资源家系中进行性状关联分析发现,Lbx1基因g.752A>G突变与眼肌面积和内脂率显著相关(P<0.05),该突变位于内含子,并不影响蛋白结构,因此该相关可能是由于g.752A>G突变与真正的功能突变处于连锁不平衡状态造成的。
　　 7.RT-PCR分析显示:MyoD和Myf5基因在未分化及分化的C2C12细胞中均表达,MyoG基因在成肌分化后期表达,另外,在C2C12细胞分化过程中始终检测到Pax7基因微弱表达。Lbx1基因在C2C12细胞中不表达。通过亚硫酸盐测序发现,在C2C12细胞成肌分化过程中MyoD,Myf5,Pax7和Lbx1基因外显子1或启动子区的甲基化密度处于动态变化中,推测这种变化影响其mRNA表达变化。