胸膜肺炎放线杆菌蛋白组互作网络的分析与子网络蛋白互作的功能验证

摘要

蛋白质是生物生命过程的真正执行者，是生命活动的基础。蛋白质互作研究是基础生命科学的一个重点领域，也是我们了解生命奥秘的窗口。研究蛋白质之间的相互作用是了解生物进程的一个重要手段，这在功能基因组学研究中起着非常重要的作用。猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae) APP引起的一种高度传染性和高死亡率的呼吸道疾病，对养殖业造成了很大的损失。本课题主要对胸膜肺炎放线杆菌强毒菌株L20株的全部基因组蛋白用同源映射的方法构建了蛋白质相互作用网络，并对该总体网络进行了功能预测与分析，根据蛋白互作度高低，COG分类分别进行归类统计。另外，我们采用细菌双杂交实验对一个以HNS蛋白为中心节点的子网络进行了蛋白互作的功能验证。
　　（1）用同源映射的方法构建了胸膜肺炎放线杆菌L20菌株蛋白互作网络，在该网络中共含有有533个蛋白和2534个互作对。我们对总网络进行了深入地分析，发现了一些新的互作关系和可能的作用机理，以及一些用实验方法难以验证和检测的蛋白互作对。
　　（2）APP子网络的分析。在互作网络中共有19个假设蛋白参与互作，这迈出了我们对假设蛋白研究的第一步，对于揭示假设蛋白的功能将有很大的意义。统计互作度位于前30位的蛋白，互作度高的蛋白大多是参与细菌细胞基础生命活动和生理代谢的蛋白质。对全基因组和互作网络中蛋白分别进行 COG分类统计。对参与细菌转录、信号转导、DNA复制、重组与修复、HNS蛋白互作子网络也进行了生物学分析，揭示了其潜在的生物学意义。
　　（3）选取HNS蛋白网络进行细菌双杂交实验,筛选的结果显示阳性率为53.8％。通过GST-pull down再次验证蛋白互作。
　　胸膜肺炎放线杆菌在各地的分离株在对抗生素的敏感性存在较大的差异，长期的用药预防和治疗产生了较大的耐药性，对胸膜肺炎放线杆菌L20菌株蛋白互作网络进行分析，可以揭示潜在的信号通路、致病机理和途径以及发现新的药物靶标，为胸膜肺炎放线杆菌临床预防和治疗提供理论支持。

目录

声明

缩略语表（Abbreviation）

1 文献综述

1.1 蛋白质相互作用网络的概述

1.1.1 蛋白质相互作用网络的意义

1.1.2 蛋白质相互作用研究方法

1.1.3 蛋白质相互作用网络的研究进展

1.1.4 蛋白质互作的评估

1.2 微生物蛋白质相互作用网络的研究进展

1.2.1 生物信息学概述

1.2.2 微生物蛋白质相互作用网络的构建

1.2.3 病原微生物研究存在的问题

1.3 研究蛋白与蛋白互作的实验方法-细菌双杂交

1.3.1 细菌双杂交技术原理

1.3.2 细菌双杂交技术在蛋白相互作用中的应用

1.3.3 细菌双杂交的缺点

1.4 猪胸膜肺炎放线杆菌概述

1.4.1 猪传染性胸膜肺炎的危害及病原学

1.4.2 猪胸膜肺炎放线杆菌蛋白互作组研究的意义

2. 材料方法

2.1 材料

2.1.1 菌株和质粒

2.1.2 主要试剂

2.1.3 质粒构建培养基、抗生素配制

2.1.4 细菌双杂交筛选所需培养基、缓冲液配制

2.1.5 pull down所需缓冲液配制

2.1.6 实验所用引物

2.2 方法

2.2.1 诱饵质粒HNS-pBT及靶蛋白质粒的构建

2.2.2 诱饵蛋白质粒与靶蛋白质粒的共转化及选择性培养

2.2.3 PCR初步鉴定共转结果

2.2.4 GST-pull down

2.2.5 APP的蛋白互作网络构建

3 结果与分析

3.1 APP的蛋白互作网络

3.1.1 胸膜肺炎放线杆菌蛋白互作网络的中互作度前30位蛋白

3.1.2 蛋白质互作网络COG类别分析

3.1.3 假设蛋白统计

3.1.4 信号转导

3.1.5 转录

3.1.6 DNA复制重组修复

3.2 细菌双杂交筛选蛋白互作结果分析

3.2.1 HNS片段的扩增及诱饵蛋白片段的扩增

3.2.2 13个基因PCR扩增及及重组质粒的构建

3.2.3 HNS蛋白与靶蛋白的互作结果

3.3 pull down实验结果分析

3.3.1 HNS片段及其他靶蛋白片段的扩增

3.3.2 GST-pull down实验中重组质粒的构建

3.3.3 GST-pull down验证蛋白互作

3.3.4 HNS蛋白子网络分析

4 讨论与结论

4.1 讨论

4.2 结论

参考文献

致谢