水稻黄单胞菌中第二信使c-di-GMP合成相关基因rrp13的功能研究

摘要

由水稻黄单胞菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae,Xoo）引起的水稻白叶枯病是水稻最严重的细菌性病害之一，严重降低了水稻产量。
　　对水稻黄单胞菌致病功能基因的鉴定和分析，尤其是全基因组测序的完成以及功能基因组学方法的应用，大大增加了对其致病机理的认识。细菌的致病性/毒性并不只是由少数几个基因控制的，而是由复杂的细胞信号通讯或群体感应机制所调控。环鸟苷二磷酸（c-di-GMP）是近十余年发现的细菌胞内第二信使，是原核生物中普遍存在的多细胞行为调节因子，通过多种交叉信号网络调控生物膜形成、耐药性、毒力因子表达等生理过程。c-di-GMP在细胞内的水平分别受到含GGDEF结构域的鸟苷酸环化酶活性（DGC,c-di-GMP合成酶）和含EAL结构域或HD-GYP结构域的磷酸二酯酶活性（PDE,c-di-GMP降解酶）的蛋白的调节，在水稻黄单胞菌中一般含有20-31个GGDEF、EAL和HD-GYP保守结构域，但是部分信号蛋白的生物学功能至今并未阐述清楚。
　　本课题结合已测序的Xoo KACC10331的全基因组信息，分析出其中含有10个GGDEF结构域，4个EAL结构域和8个GGDEF-EAL双结构域的蛋白。选取只编码GGDEF结构域的基因xoo_3988（rrp13）及编码含有GGDEF和EAL双结构域的基因xoo_2563（pdeA）进行研究。对两个基因进行克隆、表达、纯化，HPLC体外检测这两个酶是否具有c-di-GMP合成酶与降解酶的活性。其中PdeA没有检测到活性。而Rrp13能产生一种物质，但经检测不是目的产物c-di-GMP。是该酶具有其他活性，还是反应体系不完善有待进一步研究。同时，本研究采用同源双交换结合双亲本杂交法获得了rrp13的缺失突变株（Xoo△(rrp13)），经检测突变株体内c-di-GMP水平较之野生株有明显降低，表明rrp13编码的蛋白Rrp13具有DGC活性。重要的是，Xoo△(rrp13)胞外多糖以及生物膜形成较之野生菌株是增加的，自然沉降速率明显加快，运动性和对水稻的致病性则明显减弱。由此可以推测，Rrp13或者直接作为c-di-GMP合成酶调节其浓度而影响胞外基质与运动性，或者作为应答调控子调控着Xoo的多种生物学功能。总之，Rrp13与c-di-GMP信号传导相关联，这些工作为深入研究c-di-GMP信号传导机理奠定了基础。

目录

声明

缩略语表

1. 前言

1.1. 水稻黄单胞菌及其危害

1.1.1. Xoo基因组特征

1.1.2. Xoo致病机理的研究进展

1.2. 细菌第二信使环鸟苷二磷酸c-di-GMP的相关研究

1.2.1.细菌群体感应系统及信号转导

1.2.2. c-di-GMP的代谢

1.2.3. c-di-GMP的代谢调控

1.2.4.受c-di-GMP调控的细胞功能

1.2.5. c-di-GMP在细菌信号转导过程中的作用

1.2.6. c-di-GMP的待研究热点

1.3. 研究目的与意义

2. 材料和方法

2.1. 材料

2.1.1.菌株、质粒和引物

2.1.2.主要试剂与耗材

2.1.3.主要培养基及溶液的配制

2.1.4.主要仪器

2.2. 方法

2.2.1.生物信息学分析

2.2.2.敲除载体以及外源表达载体构建

2.2.3. Rrp13、PdeA的表达、纯化及活性分析

2.2.4.水稻黄单胞菌中rrp13缺失突变株的筛选

2.2.5.野生株Xoo KACC10331与突变株Xoo△(rrp13)的比较

3. 结果与分析

3.1. Xoo KACC10331中GGDEF/EAL保守结构域

3.2. 敲除载体以及表达载体构建

3.3. 蛋白Rrp13、PdeA的表达、纯化及活性分析

3.3.1. Rrp13、PdeA的诱导表达及纯化

3.3.2. Rrp13、PdeA体外酶活性分析

3.4. rrp13缺失突变株的验证及表型检测

3.4.1. rrp13缺失突变株的验证

3.4.2.野生株与突变株体内c-di-GMP含量测定

3.4.3.野生株Xoo KACC10331与突变株Xoo△(rrp13)的表型检测

4. 结果与讨论

参考文献

致谢