产酶溶杆菌第二信使C-dI-GMP合成相关基因lys385的克隆及功能分析

摘要

产酶溶杆菌（Lysobacter enzymogenes）属于黄单胞科(Xanthomonadaceae)、溶杆菌属(Lysobacter)，是一种不同于芽孢杆菌和假单胞杆菌的重要生防革兰氏阴性细菌。该菌能产生多种胞外水解酶，包括几丁质酶、纤维素酶和蛋白酶，以及小分子次生抗菌代谢产物，对植物病原真菌、卵菌和阳性细菌均有较好的抗菌活性。热稳定抗真菌因子HSAF和抗细菌物质WAP-89294A2是产酶溶杆菌产生两种新型小分子抗菌物质，分别对丝状真菌和卵菌，以及革兰氏阳性细菌具有广谱抗菌活性。目前这两种小分子抗菌物质在产酶溶杆菌体内的生物合成途径已经得到研究，但它们生物合成的遗传调控机制并未完全解析。
　　环二鸟苷酸(c-di-GMP)是细菌中的一种新型第二信使，由2分子GTP在具有GGDEF保守结构域的鸟苷酸环化酶(DGCs)的催化下合成，并可被含有EAL或HD-GYP结构域的磷酸二酯酶(PDEs)降解。已研究报道的DGCs和PDEs，通常都在N端存在一个或多个与信号接收与传递相关的结构域（如PAS和GAF等）。当这些结构域感应胞内外某种或某些信号后，会激活或抑制相应PDEs或DGCs的活性，从而改变胞内c-di-GMP含量，进而通过c-di-GMP下游特异的受体来调控细菌一系列重要的生理生化功能，如细菌的运动性、生物膜形成以及致病性。该第二信使在生防细菌抗菌产物生物合成中的调控功能研究只在革兰氏阳性细菌中被报道，在革兰氏阴性细菌中缺乏相应的研究。
　　本研究以具有自主知识产权的产酶溶杆菌菌株OH11为对象，旨在解析c-di-GMP介导的信号途径在小分子抗菌物质HSAF和WAP-8294A2生物合成中的功能。本研究通过全基因组扫描，鉴定了1个与c-di-GMP合成相关的基因，命名为Lys385。Lys385蛋白的N端含有一个cNMP结合结构域，推测其在产酶溶杆菌细胞内能结合某种核苷酸;其C端含有1个GGDEF结构域，推测其具有DGCs活性，参与c-di-GMP的合成。为探索该基因在HSAF和WAP-8294A2生物合成中调控功能，我们利用基因同源重组原理，构建了lys385的框内缺失突变体，同时构建了相应的互补菌株及过表达菌株。定量检测结果表明:lys385的缺失不影响HSAF和WAP-89294A2的产量，推测在所测条件下该基因并不参与HSAF和WAP-8294A2的生物合成，但是过表达菌株可提高HSAF产量。同时，在HSAF和WAP-8294A2的产生条传下，lys385的缺失或过量表达也不改变产酶溶杆菌对植物病原真菌（水稻纹枯病菌）的抗菌活性。为探索该基因在产酶溶杆菌其他方面的生物学功能，我们比较了野生型菌株OH11、lys385缺失突变株以及过表达菌株在胞外水解酶合成和菌落形态方面的差异，发现该基因的缺失和过量表达也不改变3种重要胞外水解酶（几丁质酶、纤维素酶和蛋白酶）的活性,表明该基因在所测条件下不参与产酶溶杆菌重要胞外水解酶的生物合成和/或外泌，但Lys385基因的过表达导致菌落表面湿润，推测该基因可能参与调控了细菌胞外多糖的生物合成。

目录

声明

摘要

上篇 文献综述

1 溶杆菌的拮抗及生防机理

1．1 溶杆菌的胞外酶

1．2 次生代谢产物

1．3 诱导抗性

1．4 Clp蛋白调控

1．5 三型分泌系统(T3SS)

2 生物防治功能

3 产酶溶杆菌中第二信使的研究进展

3．1 第二信使学说

3．2 环二鸟苷酸(c-di-GMP或cyclic di-guanylate)的研究进展

3．3 本研究的目的意义和技术路线

下篇 研究内容

1 材料和方法

1．1 供试菌株、质粒、引物和培养条件

1．2 Lys385基因突变体构建和验证

1．3 lys385基因过表达构建和验证

1．4 三种胞外酶的检测

1．5 HSAF的提取和HPLC检测

1．6 WAP-8294A2的提取和HPLC检测

1．7 lys385基因表达量的半定量PCR

1．8 lys385相关菌株对真菌的拮抗实验

2 结果和分析

2．1 lys385基因的生物信息学分析

2．2 lys385敲除突变体的构建

2．3 RT-PCR验证互补和过表达菌株

2．4 lys385突变体和过表达菌株不改变主要胞外酶的分泌量

2．5 lys385突变体和过表达菌株不影响OH11对真菌的拮抗作用

2．6 lys385过表达菌株产生HSAF的能力增强

2．7 lys385突变体和过表达菌株不影响WAP-8294A2的产量

3 讨论

参考文献

致谢