非洲猪瘟病毒P72基因单克隆抗体的制备及其重组杆状病毒的构建

摘要

非洲猪瘟(African Swine Fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African Swine FeverVirus，ASFV)引起的猪的一种急性、烈性传染病。临床上以高热、全身性出血和高死亡率为特征。该病对养猪业危害巨大，被OIE列为A类疫病。尽管我国尚无该病的传入，却时刻面临传入的风险。因此，开展该病诊断方法和疫苗的储备性研究，对于该病的防范具有重要意义。
　　 本研究利用原核表达的ASFV P72蛋白作为免疫原，制备了P72蛋白的单克隆抗体，并构建了P72基因的重组杆状病毒，为非洲猪瘟的诊断方法和免疫预防等研究奠定了基础。
　　 具体研究内容如下：
　　 1.P72基因的原核表达及其单克隆抗体的制备
　　 根据已发表的序列，设计合成了ASFV P72基因，并将其克隆至原核表达载体pGEX-KG，得到重组原核表达质粒pKG-P72。将该质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导后，SDS-PAGE检测证实，P72蛋白以可溶性形式在大肠杆菌中获得了高效表达。以纯化的P72蛋白作为免疫原，免疫BALB/c小鼠，并通过细胞融合和间接ELISA方法筛选，获得了5株能稳定分泌针对P72蛋白的特异性单抗的杂交瘤细胞株，分别命名为1E1、1F3、3F1、3D11、4F10，单抗亚类鉴定均属于IgG2a。经间接免疫荧光和Western Blot分析，获得的5株单克隆抗体均能与P72原核和真核表达蛋白发生特异性反应。
　　 2.P72基因重组杆状病毒的构建
　　 在构建真核表达质粒pcDNA-P72的基础上，用BglⅡ+XbaⅠ双酶切该质粒，获得CMV-P72表达框，并将其插入到转移载体pFast-VSV-G中，得到重组转移质粒pFast-G-P72。将该转移质粒转化DH10Bac大肠杆菌感受态，通过蓝白斑筛选得到阳性重组穿梭载体Bacmid-G-P72。将提取的重组Bacmid-G-P72 DNA转染sf9昆虫细胞，获得重组杆状病毒BV-G-P72。将重组杆状病毒转导EPC细胞，并通过间接免疫荧光实验和Western Blot分析，证实P72基因在真核细胞中得到了表达。

目录

文摘

英文文摘

缩略语表(Abbreviation)

第一章 文献综述

1.1 非洲猪瘟的病原学

1.1.1 非洲猪瘟病毒的形态与结构

1.1.2 非洲猪瘟病毒的理化特性

1.1.3 非洲猪瘟病毒的复制

1.1.4 非洲猪瘟病毒编码的主要蛋白及功能

1.2 非洲猪瘟的流行病学

1.2.1 非洲猪瘟的流行历史与地理分布

1.2.2 非洲猪瘟的易感动物

1.2.3 非洲猪瘟的传播

1.2.4 非洲猪瘟的分子流行病学

1.3 非洲猪瘟的临床表现

1.4 非洲猪瘟的检测诊断

1.4.1 病原学检测

1.4.2 血清学检测

1.5 非洲猪瘟的防治

1.6 研究目的及意义

第二章 非洲猪瘟病毒P72蛋白单克隆抗体的制备

2.1 实验材料

2.1.1 所用的寡核苷酸引物

2.1.2 质粒、菌株、细胞及动物

2.1.3 主要药品及试剂

2.1.4 主要培养基及其配制

2.1.5 主要缓冲液(溶液)及其配制

2.2 实验方法

2.2.1 引物设计

2.2.2 模板的制备

2.2.3 PCR扩增P72基因

2.2.4 DNA片段的纯化回收

2.2.5 重组质粒pKG-P72的构建与鉴定

2.2.6 P72基因诱导表达条件的确定

2.2.7 诱导表达产物的SDS-PADE分析

2.2.8 P72蛋白的可溶性分析

2.2.9 P72蛋白的纯化

2.2.10 P72蛋白的鉴定

2.2.11 免疫原与检测抗原的制备

2.2.12 动物免疫

2.2.13 间接ELISA检测方法的建立

2.2.14 间接ELISA方法检测免疫小鼠的血清效价

2.2.15 SP2/0骨髓瘤细胞的制备

2.2.16 免疫脾细胞的制备

2.2.17 饲养细胞的制备

2.2.18 细胞融合

2.2.19 阳性杂交瘤细胞的筛选

2.2.20 阳性杂交瘤细胞的亚克隆

2.2.21 单克隆抗体的大量制备

2.2.22 单克隆抗体的效价测定

2.2.23 单克隆抗体的亚类鉴定

2.2.24 单克隆抗体的间接免疫荧光检测

2.2.25 单克隆抗体的Western blot分析

2.3 结果与分析

2.3.1 P72的PCR扩增

2.3.2 重组质粒pKG-P72的鉴定

2.3.3 P72基因诱导表达条件的确定

2.3.4 P72蛋白的可溶性分析

2.3.5 P72蛋白的纯化与鉴定

2.3.6 间接ELISA检测方法的建立

2.3.7 免疫小鼠血清效价测定

2.3.8 杂交瘤细胞株的筛选与建立

2.3.9 单克隆抗体的效价测定

2.3.10 单克隆抗体的亚类鉴定

2.3.11 单克隆抗体的间接免疫荧光检测

2.3.12 单克隆抗体的Western blot分析

2.4 讨论

2.4.1 P72基因的原核表达

2.4.2 动物免疫

2.4.3 单克隆抗体的筛选

2.4.4 单克隆抗体特性分析

2.5 小结

第三章 非洲猪瘟病毒P72基因重组杆状病毒的构建

3.1 实验材料

3.1.1 质粒、细胞、菌株/毒株及动物

3.1.2 主要药品及试剂

3.1.3 主要培养基及其配制

3.1.4 主要缓冲液及其配制

3.2 实验方法

3.2.1 重组杆状病毒构建的操作流程

3.2.2 引物设计

3.2.3 PCR扩增P72基因

3.2.4 重组质粒pcDNA-P72的构建与鉴定

3.2.5 重组转移质粒pFast-G-P72的构建与鉴定

3.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备

3.2.7 重组穿梭载体(Bacmid-G-P72)的构建

3.2.8 重组穿梭载体(Bacmid-G-P72)的提取与鉴定

3.2.9 重组杆状病毒(BV-G-P72)的获得

3.2.10 重组杆状病毒BV-G-P72的纯化与毒价测定

3.2.11 重组杆状病毒BV-G-P72转导真核细胞

3.2.12 间接免疫荧光试验检测P72蛋白的表达

3.2.13 Western blot检测P72蛋白的表达

3.3 结果与分析

3.3.1 目的基因P72的PCR扩增

3.3.2 重组质粒pcDNA-P72的鉴定

3.3.3重组转移质粒pFast-G-P72的鉴定

3.3.4 重组穿梭载体(Bacmid-G-P72)的鉴定

3.3.5 重组杆状病毒BV-G-P72的获得

3.3.6 重组杆状病毒BV-G-P72的纯化与毒价的测定

3.3.7 间接免疫荧光检测重组杆状病毒P72蛋白的表达

3.3.8 Western blot检测重组杆状病毒P72蛋白的表达

3.4 讨论

3.4.1 杆状病毒表达系统

3.4.2 P72基因重组杆状病毒的构建

3.5 小结

结论

参考文献

致谢