核心顺式元件HDZIP2ATATHB2依赖的海岛棉表皮原因子1(GbPDF1)在棉花纤维起始过程中起重要作用

摘要

棉花纤维是棉花的主要产品，是世界上最重要的天然纤维。棉花纤维是在开花当天前后从胚珠外珠被表皮细胞突起后伸长而成的具有特殊结构的单细胞，一直以来被视为研究细胞伸长及次生壁合成的模式材料，同时在相关领域也取得了很好的进展。但是，就纤维如何从胚珠外珠被表皮原细胞分化形成具有突起能力的原纤维细胞、以及原纤维细胞如何向外突起形成具有快速伸长能力的纤维细胞这两个问题进行的研究虽在增多，但所取得的实验证据和理论支持还不够充足。由于成熟棉花纤维的产量及品质在一定程度上依赖于胚珠表皮细胞分化形成纤维细胞的数目以及纤维起始的时间早晚，对这一发育过程中进行分子生物学研究就显得非常必要，不仅可以丰富现有理论，在实践中为利用基因工程改良棉花纤维的产量和品质提供一条有效途径。
　　 本研究以海岛棉来源的GbPDFI为出发点，对其基因结构、表达模式以及在棉花纤维起始过程中的功能和作用机制进行了系统的分析和探讨，在分离了与之相互作用的蛋白分子之外，还对其转录调控机制进行了的研究。其主要结果如下：
　　 1.海岛棉与陆地棉中PDF1基因的结构及氨基酸序列分析
　　 根据海岛棉花纤维发育平衡化cDNA中的GbPDF1序列信息，分别从海岛棉3-79和陆地棉TM-1的基因组中扩增得到3条和2条PD目的DNA片段；根据这五条序列内含子的数目将其分为3类：TypeⅠ(无内含子)，有1个(TypeⅡ)或2个内含子(TypeⅢ)；编码氨基酸序列比对结果显示TypeⅠ与TypeⅡ所包含的三条序列几乎一致，但TypeⅢ的两条序列则具有更多“SYGGGSPP”重复单元；不同物种间PDF1蛋白在羧基端保守性较强。
　　 2.抑制棉花中PD目的表达推迟了纤维的分化
　　 通过RNAi的方法，获得了PDF1受抑制的转基因棉花植株，通过扫描电镜分析发现转基因材料胚珠表面的纤维突起进程比野生型缓慢，具体表现为：开花前12小时左右野生型已有明显可见突起的纤维细胞，而PDF1被干涉植株胚珠表面未见有纤维突起；l DPA的野生型胚珠表面纤维已开始伸长，但同一时期干涉株系胚珠上才可见到刚突起纤维细胞；PDF1表达被抑制株系成熟纤维衣分下降，长度变短。
　　 3.PDF1调控纤维发育的可能机制
　　 PDF1表达被抑制的转基因棉花胚珠中H202含量比野生型有明显的增加，但通过间接分析发现乙烯的含量没有受到促进，反倒有可能出现下降；同时由于编码碳源转运及某种特殊结构果胶多糖合成关键酶类基因表达丰度的下降，可能降低了果胶质合成的效率，最终导致纤维发育受阻。
　　 4.与GbPDF1相互作用蛋白质的分离
　　 通过酵母双杂交的方式以GAL4-DBD：：GbPDF1融合蛋白为诱饵进行筛库获得了13个可能与之相互作用的蛋白，重新转化及双分子荧光互补实验验证了三个蛋白(PPIP1，PPIP2和PPIP3)可与其发生相互作用。这三个蛋白均具有保守结构域，可能分别参与蛋白酶体介导的蛋白降解、细胞内特定膜相关蛋白的运送及H2O2含量的调控、磷脂蛋白信号传导等生理生化过程。
　　 5.烟草中超量表达GbPDF1促进其初生根增长
　　 获得了组成型启动子驱动GbPDF1在烟草中表达的T2代纯系，三次重复实验结果表明这些转基因烟草从萌发后1天开始其初生根就比野生型要长。
　　 6.GbPDF1启动子的分离及表达模式分析
　　 通过Genome-Walking的方法获得了GbPDF1基因的两条启动子序列，分别命名为PGbPDF1-1(1679bp)及PGbPDF1-2(1285bp)；这两条序列从翻译起始位点ATG开始至其上游390bp处的片段DNA组成几乎一致；分别将PGbPDF1-1和PGbPDF1-1与GUS融合获得转基因棉花植株，通过报告基因检测发现这两个启动子的具有一致的表达模式：在开花当天的胚珠中表达丰度最高，而3～15 DPA的胚珠及纤维中GUS蛋白活性逐渐降低。
　　 7.GbPDF1转录所必需启动予序列及核心顺式元件的确定
　　 通过启动子5’端的逐渐缺失发现长度为236bp的启动子足够驱动下游基因在胚珠及纤维中的表达，-128～-236bp对GbPDF1基因的转录是必须的；对该区域可能起作用的几个顺式元件分别突变后转化拟南芥，发现一个长度为9bp的名为HDZIP2ATATHB2的调控序列对该启动子正常工作是必不可少的，凝胶阻滞实验结果表明拟南芥生殖器官及海岛棉开花后5天纤维中的核提取物可与该元件在体外相互结合。
　　 根据上述研究所得结论，可以认为PDF1在棉花纤维的起始过程中行使重要的功能。PDF1在纤维起始过程中可能通过调控胚珠表皮原细胞内H2O2含量来维持乙烯和果胶质类物质的正常合成并最终形成原纤维细胞。GbPDF1基因启动子-178～-186bp处HDZIP2ATATHB2这一顺式作用元件对该基因的正常表达是必不可少的。

目录

文摘

英文文摘

缩略语表

第一章 棉花纤维细胞起始及伸长的研究进展

1.1 棉花纤维的物质组成与产量构成

1.2 有关棉花纤维原始细胞分化的几种假说

1.3 在棉花纤维发育过程中起重要作用基因的发掘与验证

1.3.1 纤维发育相关基因发掘与功能验证的一般思路

1.3.2 已发掘或验证的部分纤维发育相关基因

1.4 棉花纤维发育相关DNA/PROTEIN-PROTEIN间的相互作用

1.5 棉花纤维发育相关代谢路径

1.5.1 乙烯(Ethylene)与超长链饱和脂肪酸(VLCFAs)合成通路

1.5.2 果胶质(Pectin)合成途径

1.5.3 活性氧清除相关路径

1.5.4 碳源的合成、转运与分配

1.6 棉花纤维细胞伸长模式与机制

1.7 棉种驯化改变纤维发育过程中的基因调控网络及生物学进程

1.8 表皮原因子(PROTODERMAL FACTOR，PDF)相关研究进展

1.9 本研究目的、意义及技术路线

第二章 棉花中PDF1基因的克隆、结构及表达分析

2.1 实验材料与方法

2.1.1 实验用植物材料

2.1.2 实验方法

2.2 结果与分析

2.2.1 二倍体野生棉花及四倍体栽培棉种中PDF1基因的拷贝数分析

2.2.2 海岛棉3-79及陆地棉TM-1中PDF1基因序列的获得与比较分析

2.2.3 海岛棉3-79及陆地棉TM-1中PDF1基因3'-UTR区序列的比较分析

2.2.4 不同棉种间PD目的亲缘关系分析

2.2.5 不同物种间PD目的亲缘关系分析

2.2.6 棉花中PDF1基因的表达特性分析

第三章 棉花中PDF1基因的功能及作用机制初步分析

3.1 实验方法

3.1.1 CaMV35S：GbPDF1超量表达载体的构建

3.1.2 棉花PDF1基因干涉表达载体的构建

3.1.3 棉花下胚轴的转化与检测

3.1.4 转基因与野生型棉花胚珠的扫描电镜比较分析

3.1.5 转基因植株及野生型对照胚珠H2O2含量的测定

3.1.6 以GbPDF1为诱饵通过酵母双杂交筛选互作蛋白

3.1.7 双分子荧光互补实验进一步验证蛋白质互作的可靠性

3.1.8 CaMV35S：GbPDF1-G3GFP融合表达载体的构建

3.1.9 拟南芥的转化与检测

3.1.10 CaMV35S：GbPDF1-G3GFP载体瞬时转化烟草叶片

3.1.11 CaMV35S：GbPDF1-G3GFP载体稳定转化烟草

3.2 结果与分析

3.2.1 在棉花中超量表达GbPDF1不能正常分化成苗

3.2.2 干涉PDF1表达抑制棉花纤维的起始

3.2.3 干涉PDF1影响棉花纤维发育相关基因网络

3.2.4 GbPDF1相互作用蛋白质的分离

3.2.6 GbPD目的亚细胞定位

3.2.7 烟草中超量表达GbPDF1增加初生根长度

3.3 讨论

3.3.1 适当调整改变目的基因表达丰度的策略

3.3.2 棉花纤维起始过程中PD目的功能及其可能的作用机制

第四章 棉花中PDF1基因的转录调控分析

4.1 实验方法

4.1.1 GbPDF1启动子的克隆与顺式元件分析

4.1.2 引物延伸实验确定PGbPDF1的转录起始位点

4.1.3 启动子表达载体构建

4.1.4 启动子驱动GUS报告基因的表达载体转化材料的表达特性分析

4.1.5 凝胶阻滞验证DNA与核蛋白的体外互作

4.2 结果与分析

4.2.1 GbPDF1基因的启动子的克隆与序列分析

4.2.2 GbPDF1核心启动子区的确定

4.2.3 GbPDF1核心顺式元件的确定

4.3 讨论

4.3.1 GbPDF1与AtPDF1转录调控关键元件的不一致性

4.3.2 与HDZIP2ATATHB2互作蛋白的相关研究

小结

参考文献

附录

在读期间所发表的学术论文

申请专利

致谢