棉花SCFP纤维特异启动子顺式调控元件的初步鉴定

摘要

棉花是重要的天然纤维作物，也是重要的油料作物。棉花纤维细胞是由单个的胚珠外表皮细胞分化而成，在棉纤维的整个发育过程中，以单细胞形式存在，是研究细胞分化和发育的良好材料。决定棉花纤维产量的主要生物过程是纤维细胞的起始和延伸，然而人们对棉花纤维起始发育相关基因和调控元件的研究仍然处于初始阶段。GhSCFP(Seed Coat Fiberspecific Protease)是从棉花纤维发育早期的cDNA文库中筛选出来的一个具有纤维表达特异性的克隆，其启动子具有明显的棉花纤维表达特异性及植物种皮特异性。为了明确GhSCFP调控纤维发育的分子机理并克隆其上游调控基因，本文在前人研究的基础上，采用转基因手段，对该启动子中相关的顺式调控元件进行了功能研究，主要结果如下：
　　 1 SCFP1.2序列分析
　　 本实验将SCFP启动子继续向5'端延伸了约180bp，并利用PlantCARE分析软件对SCFP1.2序列进行分析，结果显示序列中共含有37个顺式调控元件。其中有与种子特异性相关的元件、与激素诱导相关的元件、与环境刺激相关的元件、光诱导的元件和一些功能还不确定的元件。为了获得对启动子表达有重要作用的核心序列和探索未知功能序列的作用。根据SCFP1.0启动子中调控元件的分布情况，利用5'端缺失原则，将其删除成5段序列(1064bp、946bp、739bp、530bp、464bp)并分别与GUS基因融合构建成了启动子分析表达载体。
　　 2转基因棉花植株的获得
　　 利用农杆菌侵染的转基因手段，将上述启动子表达载体转入到冀棉14中。获得SCFP0.4∷GUS、SCFP0.5∷GUS、SCFP0.7∷GUS、SCFP0.9∷GUS和SCFP1.2∷GUS的Kan抗性呈阳性转基因植株分别为10株、10株、4株、36株和29株。将获得的Kan抗性阳性转基因棉花植株，利用小量提取DNA的方法提取部分转基因棉花植株的DNA，进行PCR扩增532bp的GUS基因部分片段验证，结果显示已经获得了转基因植株。其中SCFP0.4∷GUS和SCFP0.5∷GUS转基因植株已经插种T2代，SCFP0.9∷GUS和SCFP1.2∷GUS转基因植株已经播种T1代，SCFP0.7∷GUS转基因植株播种T0代。
　　 3转基因棉花植株的GUS组织染色分析
　　 对转基因棉花植株组织化学检测结果表明，SCFP0.4～SCFP1.2中报告基因GUS的表达，在茎、叶、萼片、花冠和果柄组织中表现出一定的差异性；而该启动子长度变化对胚珠表面GUS的表达影响较大，在1.2Kb的范围内，长度越长，GUS染色越深。这进一步证明该启动子具有纤维表达特异性。
　　 4转基因棉花阳性植株组织的GUS酶活性测定分析
　　 对SCFP0.4～SCFP1.2转基因棉花植株组织GUS酶活性测定结果表明，在茎、叶、萼片、花冠和子房壁组织中的变化不明显;而对开花当天胚珠表面GUS的表达影响较大，当SCFP从1.2kb缩短到1.0kb时，GUS酶活性约降低了23.6％。当删除该启动子的-640至-549区域后，即启动子缩短为946bp，转基因棉花胚珠中GUS酶活性降低了约3倍。对于剩下的3个区域，随着启动子片段的缩短，其胚珠GUS酶活量也渐降低，但幅度不明显。因此，在SCFP0.4至SCFP1.2区域中所含有控制种子特异性的元件如Prolamin-box、RY-element、L1-box like、Skn-1-like motif、MBS和O2-site等，可能对纤维特异性有一定的作用，这种作用具有一定的累加效果。
　　 5初步研究SCFP启动子与纤维发育的关系
　　 对不同长度启动子转基因棉花植株开花后不同天数的胚珠进行GUS酶活量测定，结果显示，在开花后3天胚珠中具有比较高的GUS酶活量，表明SCFP启动子的活跃与纤维细胞的伸长有一定的相关性。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

一、文献综述

1.1棉花概述

1.1.1棉花的植物学分类地位

1.1.2研究棉花纤维发育的意义

1.1.3棉花纤维的发育过程

1.2基因启动子研究

1.2.1基因启动子的一般结构

1.2.2反式作用因子(trans-acting factors)

1.3调控元件研究进展

1.3.1基因表达调控

1.2.2调控元件研究方法

1.3.2启动子功能分析的研究意义

1.3.3棉花纤维发育相关基因的研究进展

二、引言

2.1论文的立论依据

2.2论文的技术路线

三、材料与方法

3.1材料

3.1.1植物材料

3.1.2菌株

3.1.3主要仪器与试剂

3.1.4主要缓冲液配方

3.2方法

3.2.1棉花的遗传转化

3.2.2转基因植株的PCR验证

3.2.3转基因棉花植株DNA的提取

3.2.4 GUS的组织化学染色及观察

3.2.5 GUS酶活性测定

四、结果与分析

4.1 SCFP1.2序列调控元件分析

4.2不同片段启动子指导GUS基因在转基因棉花中的表达分析

4.3转基因陆地棉中不同长度SCFP启动子功能检测

4.3.1 SCFP0.4启动子指导GUS基因表达特征分析

4.3.2 SCFP0.5启动子指导GUS基因表达特征分析

4.3.3 SCFP0.7启动子指导GUS基因表达特性分析

4.3.4 SCFP0.9启动子指导GUS基因表达特性分析

4.3.5 SCFP1.0启动子指导GUS基因表达特性分析

4.3.6 SCFP1.2启动子指导GUS基因表达特性分析

4.3.7不同片段启动子转基因棉花植株开花当天胚珠GUS酶活量测定

4.3.8不同片段启动子转基因棉花植株不同时间段胚珠GUS酶活量测定结果

五、讨论

5.1纤维特异启动子的应用

5.2启动子顺式调控元件功能与分析方法研究

5.3核心区段调控元件的功能鉴定

5.4存在的问题

六、小结

七、参考文献

致谢