大刍草苗期转录组RNA-Seq数据的De novo组装和分析

摘要

人类对玉米的驯化从10000年前农业文明起源的时候就开始了，而对于玉米祖先的争论也一直持续了很多年。近些年研究者对一些近源物种染色体形态数量、叶绿体、核糖体、同工酶及相关分子遗传学的研究表明大刍草中的Z.m.ssp。parviglumis就是玉米的祖先。本研究利用RNA-Seq技术，对大刍草的转录组进行了De novo的拼接，并对拼接得到的转录本序列进行了分析研究，包括对基因表达量的统计，与玉米B73以及其他三种单子叶植物的转录本或蛋白序列进行了比较，通过GO、KEGG、KOG、UniPort等数据库进行了简单的功能注释。
　　 本研究以6种大刍草的苗期样本为研究材料，利用solexa测序技术对其进行了RNA-Seq测序。我们首先对测序得到的序列进行了质量控制，最终保留了原始序列的77%。在确保得到了高质量的数据后，利用Trinity和TGICL软件进行了De novo的拼接，共得到了58147条大刍草转录本，它们的平均长度为1335bp，比B73转录本普遍偏短，所有的后续分析研究都基于此拼接结果。在用RT-PCR进行了序列验证后我们较为确信了拼接的准确性。接着我们采用了BLAST和BLAT两款软件将大刍草的转录本和玉米B73、高粱、短柄草和水稻进行了比较，发现了其中的高度同源序列，然后采用了RPKM值对大刍草转录本的表达量进行了估计。在对转录本的注释过程中，我们采用了几个常用的功能注释数据库，其中UniProt数据库的注释较为全面。
　　 本研究中对于大刍草转录组的研究，对大刍草和玉米在进化上的关系进行了验证，并为后来对于大刍草基因的研究提供了可参考的序列信息，将有助于后来的研究发掘在进化过程中对于玉米和大刍草形态上巨大变化发挥作用的基因。而本文中的研究方法，对没有参考基因组作物的转录组研究也能提供有意义的参考。

目录

文摘

英文文摘

1 前言

1.1 玉米的进化

1.2 测序技术进展

1.2.1 Sanger测序技术

1.2.2 第二代测序技术

1.2.3 第三代测序

1.2.4 高通量测序的应用

1.3 转录组和RNA-Seq技术

1.4 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2.1 大刍草材料

2.2 RNA的抽提

2.3 cDNA文库的构建和测序

2.4 测序数据的质量控制和拼接

2.5 表达量的统计

2.6 拼接转录本的注释

2.7 对拼接结果的验证

3 结果与分析

3.1 测序结果以及质量控制

3.2 表达量的估计

3.3 转录本的比对和注释

3.4 拼接结果的验证

4 讨论

参考文

附录

附录1 实验验证的引物序列

附录2 RNA的反转录

附录3 RT-PCR反应体系

附录4 胶回收步骤

附录5 载体连接步骤和体系

附录6 TA克隆步骤及菌液PCR体系

附录7 GO分类

在读期间发表的论文

致谢