柑橘采后生防菌柠檬形克勒克酵母(34-9)遗传转化体系的建立

摘要

柠檬形克勒克酵母(Kloechera apiculata)菌株34-9是一株对柑橘采后真菌病害具有良好防治效果的生防酵母菌株。为了提高其生防效力，进一步改良酵母以利于商业化运用，本实验主要对柠檬形克勒克酵母的遗传转化方法进行了探索，包括醋酸锂法、电转化、原生质体法及其他转化方法。在确立合适转化方法的基础上，我们将克隆抗病相关基因并使之在柠檬形克勒克酵母中高水平表达。实验室已经研究得出柠檬形克勒克酵母分泌产生的主要抑菌物质是苯乙醇，能显著抑制青、绿霉病的发生。本实验克隆了苯乙醇合成的关键酶丙酮酸脱羧酶基因PDC并在毕赤酵母中表达验证其活性，为下一步试验PDC在菌株34-9中大量表达作准备，以最终提高其拮抗效力。主要实验结果如下：
　　 1.对潮霉素B敏感性检测确定使用100μg/mL潮霉素B作为菌株34-9抗性筛选浓度。将构建了同源臂的重组载体转化到野生毕赤酵母菌X-33得到稳定转化子，验证重组载体可以用于转化。
　　 2.采用醋酸锂法、原生质体转化等方法进行了转化实验，对细胞浓度、质粒线性化和非线性化浓度、转化试剂浓度、转化后培养时间等条件进行筛选，多次试验并未得到转化子。原生质体细胞膜外DNase酶活性高，但是限制DNase活性后转化也未得到转化子，表明DNase活性并不是限制转化的主要因素。
　　 3.进行了电转化方法试验，计算酵母在不同电压下的存活率，本实验选取1.5 kV电压进行电击，并设置其他转化条件。采用电转化方法获得了少量转化子，转化效率低，初步确定转化条件为酵母浓度109 CFU/mL，50μg DNA，电压1.5 kV，电容25μF，电阻200Ω。
　　 4.克隆丙酮酸脱羧酶PDC基因。基因全长为1695 bp，翻译564个氨基酸。构建毕赤酵母表达载体pPICZαA-PDC，将重组质粒转化进X-33，得到的转化子能够在甲醇诱导下正常表达。

目录

文摘

英文文摘

1 前言

1.1 柑橘采后病害防治进展

1.1.1 柑橘常见的微生物病害

1.1.2 柑橘采后病害防治方法研究进展

1.2 拮抗酵母菌的遗传改良

1.2.1 酵母转化研究进展

1.2.2 筛选标记

1.2.3 酵母载体

1.3 转移外源基因的技术

1.3.1 原生质体转化

1.3.2 LiAc法转化

1.3.3 电转化

1.3.4 转化机理研究

1.4 PDC基因的研究

1.4.1 PDC基因

1.4.2 巴斯德毕赤酵母表达系统

1.5 课题来源和意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.2 方法

3 结果与分析

3.1 潮霉素B敏感性检测

3.2 重组载体构建过程

3.2.1 重组片段的扩增

3.2.2 整合载体的构建

3.3 重组质粒转化34-9

3.4 对照实验

3.4.1 转化方法对照实验

3.4.2 毕赤酵母对潮霉素B的敏感性检测

3.4.3 重组质粒转化毕赤酵母

3.4.4 重组载体转化毕赤酵母稳定性检测

3.5 丙酮酸脱羧酶基因的克隆及在毕赤酵母中的表达

3.5.1 丙酮酸脱羧酶表达载体构建与鉴定

3.5.2 重组质粒的转化

3.5.3 酶活检测

4 讨论

4.1 载体的选择

4.2 酵母遗传转化

4.2.1 LiAc转化

4.2.2 电击转化

4.2.3 原生质体转化

4.3 丙酮酸脱羧酶的表达

展望

参考文献

致谢