NRG1的分子进化及其在不同烟草物种TMV抗性中的作用

摘要

烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)与其抗性基因Ⅳ基因相互作用是研究植物和病原菌间相互作用经典模型。N基因起源于烟草野生种Nicotiana glutinosa，编码TIR-NBS-LRR结构域。通过VIGS实验发现一个CC-NBS-LRR基因(N requirementgenel，NRG1)在N介导的抗TMV信号传导中起重要作用。本研究用PCR方法从茄科物种中扩增获得26条NRG1序列，并且从14个已测序基因组中鉴定出NRG1直系同源体序列。对茄科中NRG1同源体序列进行正选择位点分析，仅检验出4%的正选择位点。利用NRG1氨基酸序列构建的进化树与物种之间的进化关系基本一致。这两点说明NRG1的进化与其它抗病基因不同，其序列高度保守。本研究还利用VIGS方法分析了NRG1和几个信号传导关键基因在不同烟草TMV抗性中的作用。通过构建NRG1基因和已知抗病信号传导关键基因的VIGS载体，以抗TMV烟草为材料，再利用侵染TMV观察表型和RT-PCR方法鉴定目的基因沉默效果。结果表明在N.gossei中沉默信号传导基因RAR1，NDR1，PAD4，在N.alata沉默基因RAR1，PAD4和NRG1后，分别失去了对TMV的抗性。与N基因不同，N.alata中的TMV抗性基因对TMV复制酶中的解旋酶不产生过敏反应。以上结果表明NRG1不仅参与Ⅳ介导的TMV抗性，也参与了N.alata的TMV抗性基因所介导的抗性途径。本研究还通过RNA干涉沉默NRG1基因，得到的N.repanda阳性苗通过RT-PCR方法检测成功沉默NRG1基因。NRG1在N.repandaTMV抗性中的作用在进一步研究之中。

目录

文摘

英文文摘

1 前言

1.1 抗病基因

1.2 RNA干涉(RNAi)和病毒介导的基因沉默(VIGS)

1.3.NRG1在N介导的信号传导中的作用

1.3.1 烟草花叶病毒(TMV)与抗性基因N的互作

1.3.2 N基因诱导的信号传导

1.3.3 NRG1与N共同介导TMV抗性

1.4 研究目的与意义

2.实验材料和方法

2.1 实验材料

2.1.1 植物材料

2.1.2 质粒、农杆菌材料

2.2 扩增和调取NRG1同源体

2.3 序列分析

2.4 VIGS方法沉默NRG1基因和信号传导基因

2.5 农杆菌介导的pHellsgate 8-NRG1转化烟草

2.5.1 pHellsgate 8-NRG1载体构建

2.5.2 烟草无菌苗

2.5.3 烟草转化和阳性苗检测

3.结果与分析

3.1 NRG1同源体序列分析

3.1.1 茄科中扩增NRG1同源体

3.1.2.NRG1进化分析

3.2.NRG1在抗TMV烟草中的作用

3.2.1 抗TMV烟草白化效果

3.2.2 沉默NRG1基因

3.3.3.沉默信号传导基因

3.3 转NRG1基因烟草的鉴定

4 讨论

4.1 NRG1进化上保守

4.2 VIGS是烟草研究抗病信号途径的有效方法

4.3 NRG1参与烟草中其他TMV抗性基因介导的抗病反应

参考文献

附录

1.引物序列

2.CTAB小样法提取植物基因组DNA：

3.热击法转大肠杆菌感受态

4.电转化农杆菌

5.Trizol法提取植物RNA

6.SDS裂解法提取质粒

7.试剂配方

8.烟草转化所用培养基配方

致谢