华癸中慢生根瘤菌ctrA突变体构建及其宿主互作蛋白初步筛选

摘要

ctrA在α-变形细菌中普遍存在，是细菌分裂周期和不对称分化的调控因子，在双组分调控系统中充当应答调节子。类菌体的发育也涉及到根瘤菌的分裂分化过程，分析认为ctrA基因可能参与根瘤菌类菌体分化或共生固氮，亦可能接受宿主植物来源的控制作用。但是相关的研究报道和文献很少。
　　 本实验通过构建同源双交换置换载体pJQ200SK-ctrA，试图直接筛选华癸中慢生根瘤菌7653R ctrA基因插入失活突变体。但是一直未能获得预期的突变体，考虑到ctrA基因可能存在突变致死性，本研究调整了筛选路线和策略，重新构建了ctrA渗漏表达载体pHN-ctrA和双交换质粒，为后续筛选目标突变体奠定了基础条件。
　　 另外一方面，通过构建组成型表达载体pBBR-ctrA，通过接合转移技术，将额外拷贝的ctrA引入华癸根瘤菌7653R中，观察根瘤菌自生条件和共生条件下的生长情况。结果发现其不影响7653R在自生培养时的生长；但是其共生表型为结瘤数量减少、固氮酶活性有所降低。荧光定量PCR检测ctrA表达量，结果表明：ctrA在自生和共生条件下呈组成型表达特点，且在不同时期根瘤中其表达水平差异不明显。引入额外组成型拷贝ctrA可导致根瘤中的表达量稍增强。
　　 同时，以构建pGBKT7-ctrA质粒作为诱饵，通过酵母双杂交技术，筛选前期已构建的紫云英AD-cDNA文库。最终结果获得4个阳性克隆，其中包括一个JUN激酶激活域结合蛋白。
　　 最后，基于ctrA box序列的保守性，本文对于华癸根瘤菌7653R基因组中可能接受CtrA调控的基因进行搜索和分析。结果得到64个可能受CtrA调控的基因。其中发现一个新现象，CtrA可能调控7653R中结瘤固氮相关功能基因的表达，例如opa22，minCD，ftsZ等。
　　 以上结果为后期深入探究ctrA在类菌体分化、固氦及菌植互作中的功能及调控，提供了一定的工作基础和新线索。

目录

文摘

英文文摘

缩略语表

1.前言

1.1 生物固氮

1.2 根瘤菌与豆科植物共生固氮体系

1.3 宿主豆科植物对根瘤菌类菌体分化的控制

1.4 变形细菌中的不对称分化现象

1.4.1 细胞周期

1.4.2 不对称分化

1.5 ctrA基因及其调控作用

1.5.1 CtrA对细胞周期的调控作用

1.5.2 CtrA相关的调控通路和机制

1.5.3 ctrA Box的发现和保守性

1.6 研究目的与意义

2.材料和方法

2.1 材料

2.1.1 菌株质粒和植物

2.1.2 培养基

2.1.3 抗生素

2.1.4 缓冲液与其它分子生物学试剂

2.1.5 主要实验仪器及及耗材等

2.2 方法

2.2.1 基本分子生物学操作

2.2.2 SOE-PCR

2.2.3 三亲本结合转移

2.2.4 紫云英盆栽

2.2.5 固氮酶活测定(乙炔还原法)

2.2.6 荧光定量PCR

3.结果与分析

3.1 ctrA基因插入失活突变体的构建与筛选

3.1.1 ctrA基因克隆

3.1.2 获得kan基因

3.1.3 soe PCR扩增ctrA-kan片段

3.1.4 构建pJQ-ctrA-kan重组质粒

3.1.5 重组质粒pJQ-ctrA-kan导入华癸根瘤菌7653R

3.1.6 根瘤菌7653R ctrA插入失活突变体的筛选

3.2 ctrA渗漏表达重组质粒的构建

3.2.1 构建pJQ-ctrA-kan2质粒

3.2.2 构建pHN-ctrA质粒

3.2.3 筛选ctrA双交换突变体7653R

3.3 引入额外拷贝、组成型表达ctrA对于根瘤菌生长及固氮的影响

3.3.1 组成型表达质粒pBBR-ctrA的构建

3.3.2 引入额外拷贝ctrA对于根瘤菌自生生长的影响

3.3.3 引入额外拷贝ctrA对于根瘤菌共生固氮的影响

3.3.4 ctrA表达量的比较测定

3.4 与CtrA发生相互作用的宿主蛋白初步筛选

3.4.1 构建诱饵质粒pGBKT7-ctrA

3.4.2 诱饵质粒pGBKT7-ctrA转化酵母菌株Y187

3.4.3 诱饵质粒自激活性及毒性检测

3.4.5 紫云英酵母双杂交AD cDNA文库的筛选

3.4.6 阳性克隆结果分析

3.5 根瘤菌7653R受CtrA调控的基因预测及分析

3.5.1 利用ctrA Box预测其调控基因

3.5.2 CtrA可能调控共生结瘤相关功能基因

3.5.3 CtrA蛋白系统发育分析

4.讨论与展望

4.1 讨论

4.2 展望

参考文献

附录

致谢