猪生物发酵床垫料中细菌群落结构动态变化研究

摘要

规模化的养殖推动了我国农业经济的发展，但是随之带来的环境污染问题也越来越引起人们的重视。发酵床养殖作为新型养殖技术，自从引入我国后，被大力地推广和使用，为解决畜牧环境污染问题带来了新希望。发酵床养殖技术的核心是垫料中微生物群落的活动，因此，近年来，生物发酵床微生物优势菌选育及微生物群落结构多样性变化规律成为研究的热点。
　　 本研究采用传统培养法和RFLP技术对猪生物发酵床垫料内的细菌群落结构动态变化进行研究，结果如下：
　　 1.微生物的分离鉴定试验
　　 (1)采用传统培养法，从发酵床样品中分离了30株细菌17株放线菌。
　　 (2)对分离的菌株进行有机物(淀粉、蛋白质、油脂、纤维素)降解试验，筛选出9株对有机物降解能力较强的菌株，其中细菌6株放线菌3株。
　　 (3)对6株高效细菌进行生理生化鉴定和16SrRNA鉴定，结果为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)和假单胞杆菌(Pseudomonas)；对3株高效放线菌进行了生理生化鉴定，初步判断结果为链霉菌属(Streptomyces)、螺孢菌属(Spirillospora)、孢囊菌属(Dactylosporangium)。
　　 2.RFLP技术分析
　　 (1)基因组DNA的提取试验：参照武亮(2010a)提供的蜗牛酶和蛋白酶双重酶细胞裂解法分别对保育1年期(B1)、保育2年期(B2)、保育3年期(B3)、育成1年期(Y1)、育成2年期(Y2)、育成3年期(Y3)等猪生物发酵床6个样品进行了微生物总基因组DNA的提取。琼脂糖凝胶电泳片段大小约为21kp；测得DNA/RNA之比在1.6～1.8之间，DNA浓度在300ng/ul～400ng/ul之间。因此，用本方法提取猪生物发酵床样品的微生物总基因组DNA质量较高，可以进行后续的分子生物学研究。
　　 (2)通过酶切分型分析，从保育1年、2年、3年期样品中，分别获得28、20和15个序列类型；从育成1年、2年、3年样品中分别获得30、23和17个序列类型。
　　 (3)随着使用年限增加，猪生物发酵床垫料中的微生物群落的多样性有降低的趋势。
　　 (4)生物发酵床样品中，所获得的序列归到厚壁菌门、变形菌门和拟杆菌门中，分别占克隆子总数的60%、18.2%、10%。厚壁菌门细菌对猪生物发酵床垫料中有机质的降解发挥着重要的作用，特别是芽孢杆菌属细菌和梭菌属细菌，在一年期样品和二年期样品中都是优势菌；变形菌门细菌在三年期样品中出现较多，主要参与硫、氮等物质的转化；拟杆菌门细菌主要参与物质碳循环。
　　 (5)获得了13条未知序列，它们可能是新的微生物，它们在生物发酵床垫料中作用，有待于进一步的研究。

目录

文摘

英文文摘

论文使用的符号和缩写词(Abbreviations)

第一章 文献综述

1 引言

1.1 我国畜禽养殖业污染的现状

1.1.1 水源污染

1.1.2 土壤污染

1.1.3 大气污染

1.1.4 兽药残留污染

1.1.5 疾病传播

1.2 畜禽污染的处理技术

1.2.1 粪便综合利用

1.2.2 环保饲料技术

1.2.3 畜禽业防臭剂开发

2 生物发酵床养猪技术

2.1 生物发酵床养猪技术的概念

2.2 生物发酵床养猪技术的原理

2.3 生物发酵床技术的研究进展

2.4 生物发酵床养猪技术的缺点

3 微生物多样性的研究方法

3.1 传统培养法

3.2 分子杂交技术

3.3 磷脂脂肪酸分析(PLFA)

3.4 基于16SrRNA基因微生物多样性研究技术

4 研究的目的与意义

第二章 材料和方法

1 材料

1.1 试验材料

1.2 培养基

1.3 常规试剂药品及试剂盒

1.4 常用缓冲液及试剂的配制

1.5 主要的试验仪器

2 试验方法

2.1 采样

2.2 微生物的分离、纯化及保存

2.3 分离菌株的有机物筛选

2.4 筛选菌株的生理生化鉴定

2.5 筛选细菌16SrRNA分子生物学鉴定

2.6 PCR-RFLP法分析猪生物发酵床细菌多样性

第三章 结果与分析

1 微生物的分离结果

2 分离菌株的有机物筛选

2.1 淀粉水解试验

2.2 明胶液化试验

2.3 油脂水解试验

2.4 纤维素降解试验

3 筛选菌株的生理生化鉴定

4 细菌基因组总DNA的提取

5 细菌的16SrDNA的扩增

5.1 细菌近全长16SrDNA的扩增

5.2 细菌总基因组V5-V9区16SrDAN的扩增

7 RFLP分析

8 序列和系统进化分析

8.1 保育期不同年限样品16SrDNA序列和系统进化分析

8.2 育成期不同年限样品16SrDNA序列和系统进化分析

第四章 讨论

1 微生物的鉴定方法

2 生物发酵床样品基因组总DNA的提取

3 生物发酵床样品高质量基因文库的构建

4 RFLP分析

4.1 保育期样品16SrDNA的RFLP分析

4.2 育成期样品16SrDNA的RFLP分析

5 分子发育分析

第五章 小结

参考文献

附录(获得的菌株16SrDNA基因序列)

致谢