CTV弱毒株系侵染对寄主基因表达的影响及其与强毒株系的互作研究

摘要

由柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus，CTV)引起的柑橘衰退病是柑橘上发生最为普遍且危害严重的病毒病，该病毒广泛分布于世界各柑橘产地。CTV存在明显的致病性分化，其中CTV强毒株系能够诱导以酸橙为砧木的甜橙和葡萄柚等植株木质部产生茎陷点症状，严重时引起树体快速衰退或死亡；CTV弱毒株系在寄主植物上一般不产生明显的症状。已有的研究表明病毒侵染可引起寄主植物基因表达的变化，且寄主植物症状表现与基因表达的时序变化有关。CTV弱毒株系侵染虽然在柑橘上不产生明显可见症状，但该病毒可在寄主植物中系统扩展和增殖，即二者间表现为亲和性互作。为明确CTV弱毒株系与寄主的互作特点，本研究以CTV弱毒株系N4为研究对象，分析了CTV-N4的侵染对寄主基因表达的影响，并对相关基因的表达时序动态进行了监测；通过对CTV强毒株系及弱毒株系交互接种的寄主生物学表现及二者的相对含量进行RT-PCR分析。主要研究结果如下：
　　 1、以感染CTV-N4和健康墨西哥莱檬植株为材料，采用抑制性差减杂交技术(SSH)构建了CTV-N4侵染寄主上调和下调表达基因EST文库。通过反向Northern斑点杂交技术对两个差减文库进行筛选，共获得了589个差异表达EST。测序及同源序列搜索和比对分析的结果显示，这些差异表达EST共代表202个差异表达基因，其中CTV-N4诱导寄主上调表达的基因有111个，下调表达的基因有91个。采用实时荧光RT-PCR技术对13个随机选取的EST在健康和CTV-N4侵染莱檬植株中的相对表达量进行了比较分析，结果显示CTV-N4侵染墨西哥莱檬后在不同程度上诱导或抑制了这些基因的差异表达，其中8个基因上调表达倍数为1.1-47，5个基因的下调表达倍数为1.2-1.8。在上调表达基因中，所占比例最大的为胁迫和病害防御相关基因，占27.9%；信号转导相关基因所占比例最小，为5.4%；细胞结构及转运、转录、代谢、能量及蛋白质合成相关基因各占15.3%、12.7%、11.7%、9.0%和6.3%。在下调表达基因中胁迫和病害防御、能量、细胞结构及转运和转录相关基因各占17.6%、13.2%、13.1%和4.4%。功能未知ESTs各占上调和下调表达基因的11.7%和22.0%。
　　 2、采用实时荧光定量RT-PCR技术比较分析了CTV强毒和弱毒株系侵染株檬植株中编码几丁质酶、咖啡酸-3-甲基转移酶和脂质转移蛋白的基因表达时间动态特点，结果显示CTV强毒和弱毒株系侵染均能不同程度地诱导这三个基因的表达，CTV强毒株系对这三个基因的诱导作用要明显强于弱毒株系。接种60d后，几丁质酶在接种N4和N21的莱檬植株中的上调表达量达到高峰，分别上调14和31倍，随后其表达量迅速下降，在接种第120d后其上调表达量分别为对照植株中的1.9和6.4倍。咖啡酸-3-甲基转移酶的上调表达与几丁质酶相似，在接种第60d达到峰值，在N4和N21侵染的植株中分别上调2.3和5.7倍，随后其表达量急剧下降。脂质转移蛋白的上调表达量相对较低，在N21和N4侵染植株中分别上调1.6-2.5和1.1-1.4倍。比较三个基因在先后接种不同CTV株系的莱檬寄主中的相对表达量时发现先期侵入寄主的CTV株系均在一定程度上抑制了随后入侵的CTV株系对寄主基因的诱导效果。
　　 3、CTV强毒株系N21在莱檬、甜橙和HB柚植株上可引起新生叶片的褪绿和黄化及植株生长势减弱和矮化。先接种CTV弱毒株再接种强毒株N21仅在甜橙上症状有所减轻。
　　 4、采用株系特异性RT-PCR初步评价了CTV弱毒株N3或N4与强毒株N21混合接种植株中各病毒株系相对含量的时间动态变化，结果表明，在感染N3或N4的3种寄主上接种N21约90d后，N3和N4检出率逐渐降低，至第150d时分别降至50%和45%。而N21在各接种植株的相对含量变化呈现与N3和N4相反的变化趋势，其检出率随接种后时间的延长而提高，至接种120d后，N21在各接种植株中的检出率达95%。同时CTV含量变化因寄主不同而存在一定的差异，在甜橙上N3和N4检出率下降相对较缓慢，而N21在甜橙植株中增殖相对较慢。于接种210d后，采用半巢式RT-PCR对部分检测结果为阴性的植株中的N3和N4进行了检测，结果显示所分析的植株中都能扩增到CTV弱毒株的特异性目标片段。此外，本结果表明，在N4和N21混合接种的莱檬植株中，强毒株N21的复制能力明显高于弱毒株或对弱毒株N4的复制有一定的抑制作用。
　　 5、于接种18个月后，对混合接种莱檬植株中CTV外壳蛋白基因RT-PCR扩增产物进行了克隆和测序。结果表明，在混合接种的莱檬中CTV弱毒株的含量明显低于强毒株。且交互接种方式对CTV弱毒株的含量有一定的影响，在接种N21+N4植株所占比例较在接种N4+N21植株中明显偏低，该结果与RT-PCR分析结果相一致。序列比对结果显示，先期接种的CTV弱毒株对后期接种的强毒株N21群体结构有一定的影响，有2个CP克隆在10个氨基酸位点发生了突变。

目录

文摘

英文文摘

缩略词表(Abbreviation)

第一章.柑橘衰退病毒的国内外研究进展

1.1 柑橘衰退病发生概况

1.2 柑橘衰退病毒的生物学特性

1.2.1 柑橘衰退病毒的寄主范围

1.2.2 柑橘衰退病毒的传播途径

1.2.3 柑橘衰退病毒的株系分化

1.3 柑橘衰退病毒的分子生物学特性

1.4 柑橘衰退病毒的检测技术

1.4.1 生物学鉴定

1.4.2 血清学鉴定

1.4.3 分子生物学鉴定

1.5 植物对病毒的抗性

1.5.1 抗病基因介导的抗性

1.5.2 RNA沉默介导的病毒抗性

1.6 病毒侵染对寄主基因表达的影响

1.6.1 筛选寄主差异表达基因的常用方法

1.6.2 CTV侵染对寄主的影响

1.7 柑橘衰退病的防治

1.7.1 脱除病毒技术

1.7.2 弱毒株系交叉保护

1.7.3 抗病毒基因工程

1.8 本课题的研究目的与意义

第二章 CTV弱毒株系诱导墨西哥莱檬差异表达基因的筛选

2.1 前言

2.2 材料与方法

2.2.1 病毒来源与寄主材料

2.2.2 主要仪器及试剂

2.2.3 总RNA的提取

2.2.4 mRNA的纯化

2.2.5 SSH文库的构建

2.2.6 差减文库的筛选

2.2.7 差异表达片段的qRT-PCR验证

2.3 结果与分析

2.3.1 差减文库构建效果

2.3.2 差异表达片段的反向Northern斑点杂交筛选

2.3.3 部分ESTs差异表达量的qRT-PCR分析结果

2.3.4 差异表达ESTs的序列分析及功能分类

2.3.5 CTV不同致病力株系对寄主基因表达影响的比较分析

2.4 讨论

2.4.1 病毒株系与寄主基因表达

2.4.2 病害防御与压力应答类基因

2.4.3 转录相关类基因

2.4.4 能量相关类基因

2.5 小结

第三章 CTV不同株系诱导墨西哥莱檬基因表达的时间动态分析

3.1 前言

3.2 材料与方法

3.2.1 毒源与寄主材料

3.2.2 接种方法

3.2.3 qRT-PCR引物的设计

3.2.4 总RNA的提取

3.2.5 qRT-PCR

3.3 结果与分析

3.3.1 qRT-PCR扩增条件的优化

3.3.2 目标基因qRT-PCR扩增曲线和溶解曲线分析

3.3.3 CTV不同株系侵染对寄主基因表达的时间动态影响

3.4 讨论

3.5 小结

第四章 CTV强毒和弱毒株系混合侵染柑橘植株的生物学表现及二者含量的时间动态变化

4.1 前言

4.2 材料与方法

4.2.1 试验材料

4.2.2 接种方法

4.2.3 引物设计

4.2.4 RT-PCR

4.3 结果与分析

4.3.1 CTV不同株系的生物学表现

4.3.2 CTV弱毒株接种效果

4.3.3 CTV强毒株在弱毒株接种柑橘植株中的相对含量变化

4.3.4 柑橘不同品种对CTV强毒和弱毒株含量的影响

4.3.5 交互接种的寄主植物中CTV弱毒株的巢式RT-PCR检测

4.3.6 不同接种方式对CTV强毒和弱毒株在寄主中增殖的影响

4.3.7 CTV强毒和弱毒株在混合接种莱檬植株中的种群结构

4.4 讨论

4.5 小结

第五章 结论与展望

参考文献

图版与说明

附录1：差减文库所用接头和引物信息

附录2：正、反向差减文库差异片段与已知基因同源性比对结果

附录3：主要试剂及溶液的配制

附录4：博士在读期间已发表或已接受的文章

致谢