禽流感病毒H9N2适应小鼠致肺脏CD4+T细胞Th17应答的研究

摘要

禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)是分节段负链RNA病毒，属于正粘病毒科。在自然条件下，禽流感病毒不但可以感染鸟类，还可以感染水貂，猪，马等哺乳动物。AIV禽-人传播导致对其潜在流行性的恐慌，AIV感染哺乳动物的分子机制并不完全清楚。此外，宿主应对禽流感病毒感染的免疫反应依然不完全清楚。基于此，本研究以AIV H9N2为研究对象，建立AIV H9N2的小鼠感染模型，研究了AIV H9N2致小鼠毒力增强的分子机制及宿主应对H9N2的免疫反应。具体内容如下：
　　 1.基因组多氨基酸置换导致AIV H9N2致小鼠毒力增强
　　 AIV H9N2感染人的发现需要更好的理解AIV种间传播的机制。本研究中，我们通过将H9N2野生株病毒(A/chicken/Hubei/01/1999)连续小鼠传代获得小鼠适应株病毒(ma01)。Ma01导致小鼠高致死率，严重的肺病理损伤及扩大的病毒组织分布。Ma01基因组具有9个氨基酸置换，分别位于5个病毒基因(PB2，PA，NA，M1和NS1)。在这些氨基酸突变中，PB2-627，PA-349，PA-605，NA-88和NA-356不存在其他H9N2临床分离株中。此外，存在于野生株病毒基因组中的小鼠microRNAmmu-mir-1940和mmu-mir-1904靶位点，在ma01株基因组中突变消失。被先前的研究所证实的决定AIV H5N1对小鼠毒力的氨基酸突变－－PB2-627(同样出现于Ma01中)正位于mmu-mir-1904靶位点。使用荧光定量PCR发现，与野生株相比小鼠感染ma01毒株诱导肺脏更高水平的细胞因子IL-1β(P<0.05)，IL-6(P<0.05)，TNF-a(P<0.05)和MIP-1a(P<0.05)表达差异。此外，使用ELISA方法分析小鼠外周血细胞因子水平，与野生株相比小鼠感染ma01毒株诱导更高水平的细胞因子IL-1β(P<0.05)，IL-6(P<0.05)，TNF-a(P<0.05)和IFN-β(P<0.01)。这些结果说明多氨基酸置换及逃逸宿主microRNA抑制作用可能导致ma01致死性小鼠感染，组织高病毒载量及过度的细胞因子释放。
　　 2.神经氨酸酶涉及禽流感病毒感染导致的小鼠肺脏CD4+T细胞Th17反应
　　 禽流感病毒感染导致细胞因子失调与疾病严重性相关。本研究中，基于AIV小鼠感染模型，我们发现H9N2感染诱导肺脏高水平的TGF-β1和IL-17A释放，使用流式分析发现肺脏CD4+T细胞Th17亚群数量增加，与mock对照7.87%相比，AIV感染CD4+/IL-17A细胞上调16.3%。进一步研究发现，流感病毒神经氨酸酶涉及CD4+T细胞Th17反应这一过程，通过诱导树突细胞成熟上调表面标志分子CD40，CD80，CD83和MHCⅡ。神经氨酸酶诱导树突细胞释放细胞因子TGF-β1，TNF-α和MIP-1α。通过体外树突细胞与CD4+T细胞共培养及CD4+T细胞体外诱导分化实验发现，神经氨酸酶不能直接诱导CD4+T细胞Th17分化，其效应需要树突细胞。此外，神经氨酸酶处理可以增强LPS，Poly(I：C)和HMGB1诱导树突细胞成熟效应。

目录

文摘

英文文摘

缩略语表(ABBREVIATION)

第一章 文献综述

1.1 禽流感病毒感染哺乳动物分子机理研究进展

1.1.1 流感病毒唾液酸受体特异性与病毒跨种间传播

1.1.2 禽流感病毒RNA聚合酶突变适应哺乳动物细胞

1.2 流感病毒感染与microRNAs研究概述

1.2.1 病毒编码的及宿主内源microRNAs与病毒感染关系

1.2.2 流感病毒与microRNAs

1.3 流感病毒感染与宿主免疫应答研究概述

1.3.1 高致病性禽流感病毒感染致宿主过激的免疫反应

1.3.2 CD4'T细胞Th17亚群分化研究进展

1.3.3 流感病毒编码基因调控宿主免疫

第二章 AIV H9N2适应小鼠后毒力增强

2.1 前言

2.2 实验材料

2.2.1 菌株与毒株

2.2.2 鸡胚与小鼠

2.2.3 分子克隆相关试剂

2.3 实验方法

2.3.1 禽流感病毒H9N2适应小鼠

2.3.2 小鼠感染模型

2.3.3 分离病毒RNA，RT-PCR及测序分析

2.3.4 病理切片与免疫组化

2.3.5 小鼠肺脏细胞因子荧光定量PCR分析

2.3.6 小鼠外周血细胞因子表达差异ELISA分析

2.3.7 病毒基因组微小RNA靶位点变动分析

2.3.8 统计学方法

2.4 结果及分析

2.4.1 禽流感病毒H9N2适应小鼠致毒力增强

2.4.2 小鼠适应株基因组多个氨基酸突变

2.4.3 小鼠适应株感染导致肺及外周血细胞因子水平升高

2.4.4 小鼠适应株基因组两个microRNAs识别位点丢失

2.5 讨论

2.5.1 多氨基酸突变影响禽流感病毒H9N2哺乳动物致病性

2.5.2 物种特异表达的microRNAs与禽流感病毒跨种传播

2.5.3 禽流感病毒感染与宿主细胞因子

第三章 AIV H9N2感染致小鼠肺脏CD4+T细胞TH17应答

2.1 前言

2.2 实验材料

2.3.1 毒株与小鼠

2.3.2 细胞培养试剂

2.3.3 细胞因子及流式试剂

2.3 实验方法

2.3.1 小鼠骨髓来源树突细胞培养

2.3.2 小鼠脾脏CD4+T淋巴细胞的分离

2.3.3 流式分析

2.3.4 胞内细胞因子流式分析

2.3.5 细胞因子ELISA分析

2.3.6 CD4+T细胞分化

2.3.7 树突细胞与CD4+T细胞共培养

2.3.8 统计学方法

2.4 结果与分析

2.4.1 禽流感病毒H9N2感染小鼠诱导肺脏CD4+T细胞Th17极化

2.4.2 神经氨酸酶诱导树突细胞成熟释放TGF-β1

2.4.3 神经氨酸酶增强LPS，Poly(I：C)，HMGB1致树突细胞成熟作用

2.4.4 神经氨酸酶诱导CD4+T Th17极化

2.5 讨论

2.4.1 禽流感病毒H9N2感染小鼠诱导肺脏CD4+T细胞Th17极化

2.4.2 神经氨酸酶诱导树突细胞成熟释放TGF-β1

2.4.3 神经氨酸酶诱导CD4+T Th17极化

结 论

参考文献

论文发表

致谢