干旱胁迫下甘蓝型油菜消减文库的构建及分析

摘要

干旱是非生物胁迫中对农作物生长和产量影响最大的胁迫之一。世界范围内，每年由于干旱胁迫造成的损失相当于其他所有环境因子造成的总和。油菜干旱灾害是我国和其他主产国家经常性的自然灾害，中度干旱可导致油菜单产降低20%以上，严重时甚至绝收。我们前期研究发现，油菜耐旱品种在干旱胁迫下生长发育和产量相对稳定，基于分子生物学方法考察其在干旱胁迫条件下的应答机制，将有益于探究其抗旱分子机理，全面理解抗旱性遗传基础，对于抗旱新品种培育和抗旱栽培技术研发具实践价值。
　　 本研究以甘蓝型油菜抗旱品系Q2为材料，用模拟干旱方式诱导基因表达，采用抑制性消减杂交技术(SSH)构建了富含甘蓝型油菜Q2根和叶片抗旱相关基因片断的差减文库。应用反向Northern杂交技术对文库进行了筛选，并选取了三个阳性克隆进行了Real-time PCR验证。对选取的186个阳性克隆进行测序，同源检索结果显示，有156个片段能找到与之同源性高的基因。基因功能分类显示，所占比例分别为：1：代谢相关11.1%；3：催化及抗氧化活性10.9%；4：信号转导：10%：5：转录调控6.4%；6：转运相关3.8%；7：翻译调控：2%；8：蛋白质降解1.3%；9：抗性相关：1%；10：能量代谢1%；11：未分类36.4%；12：功能未知16.1%。
　　 就ESTs来源来看，绝大部分来源于拟南芥、甘蓝型油菜、甘蓝、大白菜、百合等植物。其中，功能分析结果发现已知功能的ESTs156条主要参与干旱胁迫应答的光合作用及叶绿体结构建成、抗性及防御、膜和转运类、转录相关功能以及信号转导。获得与抗旱密切相关的捕光叶绿素A/B结合蛋白、1，5-二磷酸核酮糖羧化酶、过氧化物酶、磷脂酰肌醇转运蛋白、ABC转运子、转录因子、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、GTP结合蛋白等重要基因的ESTs。这些ESTs基本上反映了干旱胁迫下甘蓝型油菜基因的表达谱。
　　 对文库中获得的两个基因B、C(与过氧化物酶同源性很高)及一个未知功能ESTsA基因利用反转录PCR技术分析其表达情况。发现A、B、C在干旱胁迫后不同时间点的表达量差异较大，但三者的最高表达均发生在干旱胁迫后12 h。进一步利用荧光定量PCR技术对反转录PCR结果中的3条差异表达ESTs进行精确定量。计算结果表明，3条ESTs的表达量在干旱胁迫后呈波动性变化，并且在基因表达过程中，三个基因分别在3小时有个降低的趋势，而在12小时后，功能基因得到大量表达，24小时达到高峰。说明干旱胁迫后12-24 h是甘蓝型油菜表现抗旱性的关键时间点。

目录

文摘

英文文摘

1 前言

1.1 油菜干旱的危害及研究现状

1.2 作物对干旱的分子响应

1.2.1 干旱胁迫诱导基因的功能

1.2.2 干旱胁迫的信号转导及其诱导基因的表达调控

1.3 基因差异表达的研究方法

1.3.1 cDNA代表性差异分析

1.3.2 基因芯片技术

1.3.3 表达序列标签

1.3.4 基因表达连续性分析

1.3.5 差减杂交技术及其应用

1.4 抑制差减杂交的基本原理与优缺点评价

1.5 本研究的目的、意义及应用

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.2.1 差减cDNA文库构建

2.2.2 反向northern杂交

2.2.3 荧光定量PCR

2.2.4 序列测定分析和基因功能预测

3 结果与分析

3.1 总RNA的电泳及浓度测定

3.2 cDNA合成及Rsa Ⅰ酶切效率分析

3.3 接头连接效率检测

3.4 两次差减产物PCR扩增

3.5 差减效率检测

3.6 插入片段大小检测

3.7 反向Northern斑点杂交筛选结果

3.8 基因功能分类

3.9 荧光定量PCR验证

4 讨论

参考文献

附录

致谢

发表和已经准备的论文