干旱胁迫下柽柳抑制性消减杂交文库的建立及EST分析

摘要

为研究干旱胁迫下柽柳基因的表达，以干旱处理下的柽柳为tester，以正常生长条件下的柽柳为driver，利用SSH(抑制性消减杂交)技术分别构建了干旱胁迫处理的刚毛柽柳根部消减cDNA文库和多枝柽柳叶部消减cDNA文库。 对刚毛柽柳根部消减eDNA文库的分析。随机挑取刚毛柽柳文库中的192个阳性克隆进行测序，共获得125条高质量的序列，其GenBank登录号为CN121095～CN121219。BLASTX分析结果表明，有17个与已知抗旱基因相关的EST，其中包括Mn-SOD、myb相关蛋白、锌指蛋白等。 对多枝柽柳叶部消减cDNA文库的分析。随机挑取多枝柽柳文库中的384个阳性克隆进行测序，共获得347条高质量的序列，GenBank登录号为CV794679～CV795025。利用NCBI的BLASTX程序进行同源性比较和功能分析。结果表明，有144个EST与已知功能的基因序列相似，24个与未知功能的基因相似，179个未能发现相似序列，可能为新基因。将与已知基因具有序列相似性的168个EST按预测功能分为13类，其中新陈代谢和光合作用涉及的基因表达丰度最高，分别为16.7％、14.9％。共获得的88个与抗旱相关的EST，代表了67个单一的基因序列，将其按预测功能分为11类：光合作用、信号传导、防御、代谢、活性氧清除、蛋白质降解、膜流动、蛋白质合成、渗透调节剂合成、膜转运和转录调控。分析结果表明，与光合作用、信号传导、防御、代谢和活性氧清除等功能相关的基因表达丰度最高，分别为11.31％、8.93％、7.74％、7.74％和7.14％，提示此类基因在柽柳抵抗干旱胁迫过程中起到了重要作用。 获得的重要抗旱相关基因主要有：钙依赖蛋白激酶3(calcium-dependentproteinkinase3)、钙调蛋白(calmodulin)；Mn-SOD(manganesesuperoxidedismutase)、谷胱甘肽还原酶(glutathionereductase)；脱水诱导蛋白(RD22dehydration-responsiveproteinRD22)、干旱诱导蛋白1(drought-inducedprotein1)；真核生物翻译起始因子5A-2(eukaryotictranslationinitiationfactor5A-2)、泛素交联酶(ubiquitin-conjugatingprotein)；苹果酸脱氢酶(Malatedehydrogenase)、硫-腺苷甲硫氨酸合成酶(S-adenosylmethioninesynthetase)等。

目录

文摘

英文文摘

1绪论

1.1植物抗旱性研究概况

1.1.1植物抗旱性及抗旱机制

1.1.2植物抗旱基因工程及树木抗旱性研究

1.2生物信息学与表达序列标签

1.2.1基因组学

1.2.2生物信息学

1.2.3表达序列标签(EST)

1.3抑制性消减杂交(SSH)

1.3.1 SSH技术的基本原理

1.3.2 SSH技术的主要过程

1.3.3 SSH技术的优点

1.3.4 SSH技术在植物上的研究进展

1.4柽柳

1.4.1柽柳及其干旱适应特征

1.4.2柽柳的水分胁迫调节机制研究

1.4.3研究的目的和意义

2干旱胁迫下刚毛柽柳抑制性消减文库的构建

2.1实验材料

2.1.1材料及处理

2.1.2主要酶及化学试剂

2.1.3引物

2.2实验方法

2.2.1总RNA提取及其消化

2.2.2 RNA反转录

2.2.3 PCR扩增

2.2.4抑制消减杂交

2.2.5文库的构建及克隆长度的鉴定

2.2.6 DNA测序与同源性比较

2.3结果与分析

2.3.1 RNA定性分析

2.3.2 cDNA文库消减效率的分析

2.3.3 SSH文库的质量分析

2.3.4 cDNA测序与同源性分析

2.4本章小结

3干旱胁迫下多枝柽柳的消减cDNA文库的构建

3.1实验材料

3.1.1材料及处理

3.1.2菌种及载体

3.1.3主要酶及化学试剂

3.1.4引物

3.1.5 LB培养基配方

3.1.6主要仪器设备

3.1.7分析软件

3.2实验方法

3.2.1 SDS法提取柽柳总RNA

3.2.2磁性球珠分离mRNA

3.2.3抑制消减杂交文库的构建

3.2.4载体的连接及转化

3.2.5插入片段长度的检测

3.2.6质粒培养

3.2.7模板制备

3.2.8测序PCR反应

3.2.9测序

3.2.10序列分析

3.3结果与分析

3.3.1 RNA的提取及mRNA的分离

3.3.2 SSH文库构建及质量检测

3.3.3 DNA序列测定

3.3.4 EST结果分析

3.4本章小结

结论

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文

致谢