玉米BAC/BIBAC基因组文库构建和水稻bZIP转录因子IX亚族成员OsbZIP84功能鉴定

摘要

本研究主要分为两个部分，第一部分为两个BAC和BIBAC载体的改建以及利用这两个载体构建玉米大片段基因组文库，另一部分为水稻bZIP家族第九亚族成员OsbZIP84的功能研究。
　　细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome, BAC）是近年来应用最广泛的大片段基因组文库构建载体。双元细菌人工染色体（ binary bacterial artificial chromosome, BIBAC）是在BAC载体的基础上发展而来的既可用于基因组文库构建又可用于农杆菌介导的遗传转化的载体。BAC和BIBAC文库已经用于多种真核生物的物理图谱的构建、全基因组测序、图位克隆等研究，是真核生物结构和功能基因组学研究的重要工具。本研究构建了一对BAC和BIIBAC载体，方便了BAC和BIBAC文库的构建以及完整的外源片段在两个载体之间的转移，并且分别以这两个载体构建了玉米Mo17 BAC文库和B73 BIBAC文库。主要结果如下：
　　1.在改建的BAC载体pIndigoBAC536-S、BIBAC载体BIBAC-S的LacZ基因两侧设计了I-SceI位点。I-SceI巢式内切酶有18个碱基的识别位点，酶切后产生不可自连的粘性末端。I-SceI在水稻和拟南芥中都没有识别位点，在玉米中也仅有两个识别位点，因此 I-SceI位点非常适合外源插入片段的精确检测，同时也方便了完整的外源大片段在BAC和BIBAC载体之间定向互换，进而用于植物转化。
　　2.为了提高BIBAC文库质量，我们用LacZ基因替代了BIBAC2上的SacB细菌筛选标记，蓝白斑的筛选使得阳性克隆的筛选更加快捷和精确，同时大大减少了假阳性的概率。
　　3.两个单拷贝的载体分别与高拷贝载体pGEM-4Z连接，形成高拷贝的质粒，命名为pHZAUBAC1和pHZAUBIBAC1，这两个高拷贝载体大大提高了质粒的获得效率，从而减小了载体制备的时间和工作量，提高了文库构建效率。
　　4.为了检验这两个载体转移部分和完整片段的能力，将两个 MH63BAC克隆和两个Mo17BAC克隆分别利用NotI和I-SceI酶切并成功连接到BIBAC-S载体上，方便了目的片段的植物遗传转化。
　　5.我们利用pIndigoBAC536-S载体构建了玉米Mo17 BAC文库，平均插入片段大小为120kb，共有15万个克隆，覆盖7倍基因组；利用BIBAC-S载体构建了玉米B73 BIBAC文库，平均插入片段分为90kb和105kb两个梯度，包含20万个克隆，覆盖7倍基因组。
　　水稻是我国以及全世界最重要的粮食作物，也是禾本科作物研究的模式作物。碱性亮氨酸拉链（Basic leucinezipper，bZIP）是一类植物体内重要的转录因子，也是植物中研究最多的转录因子家族之一，参与调控病原菌侵染、光路径、各种非生物逆境胁迫、种子的成熟和花的发育等过程，是植物生长发育过程中必不可少的一类转录因子。
　　水稻bZIP家族第九亚族成员研究的并不多，在11个成员中只有两个基因有过研究报道，这两个基因均在植株的韧皮部和木质部的维管束中表达，与植株的发育相关。本研究分析了水稻bZIP转录因子第九亚家族的各个成员的表达模式和蛋白质结构域，特别对这个亚族成员OsbZIP84的功能做了进一步步分析，通过克隆、超量表达、RNA抑制等方法发现这个基因可能参与植株的赤霉素合成，从而影响植物的生长发育。OsbZIP84基因的研究为这个亚族其他转录因子的研究提供了参考。主要结果如下：
　　1.水稻bZIP-IX亚家族有11个成员，这个家族的成员有典型的bZIP结构域和基本的碱性区域，在结构上与其他亚族不同的特点是在保守的碱性DNA结合域中赖氨酸残基代替了高度保守的精氨酸，这个氨基酸的转变可能决定了这些bZIP蛋白对非回文序列的结合位点的特异性识别。水稻第IX亚族成员的bZIP结构域比较保守，且有相同的内含子插入位点，表达谱数据分析发现这个亚族中OsbZIP84成员的各个组织中的表达量较其他成员高。与其他物种的同亚族的成员同源比对发现，OsbZIP84与拟南芥中的AtVIP1和烟草中的RSG有很高的相似性。
　　2. OsbZIP84基因的启动子部分包含大量的逆境胁迫反应元件和以及 ABA反应元件。我们利用Real-time检测发现OsbZIP84受到各种生物和非生物逆境胁迫以及各种植物激素的处理后激活表达。OsbZIP84在水稻的剑叶、叶鞘、茎节、幼穗和颖壳中的表达较高，而在根和幼芽中的表达较低。
　　3.亚细胞定位显示该蛋白定位在细胞质和细胞核中，并且在细胞质中的积累要高于细胞核。BIFC证明OsbZIP84蛋白既可以形成同源二聚体也可以和AtVIP1形成异源二聚体，同时发现C端的结构域对二聚体的形成起关键作用。
　　4.酵母体内实验证明OsbZIP84有强的自激活能力，我们通过分段验证发现转录激活域为其N端富含酸性氨基酸的结构域。
　　5. OsbZIP84超表达植株诱导的愈伤并不能提高农杆菌侵染的效率，转基因植株生长正常，但愈伤的分化能力受到抑制。在ABA处理下，超表达植株幼苗生长同野生型相似，没有显著差异。
　　6. OsbZIP84抑制表达的植株矮化，在培养基上用赤霉素诱导发现，植株表型恢复，表型恢复的程度与赤霉素的浓度相关。在田间对矮化植株喷洒赤霉素，植株表型也有一定程度的恢复，说明矮化表型可能是由于缺乏赤霉素引起。

目录

声明

缩写名词表

1 前言

1.1 玉米和水稻研究的重要性

1.2 大片段克隆载体的研究进展

1.3 双元载体的发展

1.4 大片段遗传转化的研究进展

1.5 水稻bZIP转录因子第九（IX）亚族研究进展

1.6 植物基因功能的研究策略和方法

1.7 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2.1 水稻和玉米材料

2.2 实验所用菌株、质粒、载体、和感受态细胞

2.3 BAC载体pIndigoBAC536-S的构建

2.4 BIBAC-S载体的构建

2.5 构建高拷贝的 BAC 载体 pHZAUBAC1 和 BIBAC 载体pHZAUBIBAC1

2.6 文库构建

2.7 NotI酶切位点完成BAC载体的外源片段向BIBAC载体的转移

2.8 I-SceI酶切位点完成BAC载体上的完整外源片段向BIBAC载体

2.9 基因序列分析

2.10 农杆菌介导的水稻遗传转化

2.11 DNA抽提

2.12 RNA抽提

2.13 PCR，RT-PCR和Real-time PCR 检测

2.14 酵母细胞转化实验

2.15 转基因水稻植株的分析

3 结果与分析

3.1 高拷贝BAC载体pHZAUBAC1和BIBAC载体pHZAUBIBAC1

3.2 用新构建的载体完成玉米Mo17和B73大片段基因组文库的构建

3.3 用NotI酶切位点完成目的片段从载体BAC向BIBAC-S的转移

3.4 用I-SceI酶切位点完成完整BAC插入片段向BIBAC-S载体的

3.5 水稻bZIP-IX亚族成员OsbZIP84功能分析

3.6 OsbZIP84的超表达植株的逆境分析

3.7 RNAi植株表型分析

3.8 突变体分析

3.9 顺势元件的识别

4 讨论

4.1 BAC和BIBAC载体改建

4.2 OsbZIP84的功能初探

参考文献

附录A 部分实验操作流程

附录B 个人简历

致谢