棉花EST来源抗病基因同源物的挖掘、遗传定位与表达分析

摘要

棉花是世界上最主要的纤维作物，也是一种重要的油料作物。调查显示，中国棉花生产中由于病害造成的经济损失约为15％。然而在棉花中还没有克隆到R基因。根据抗病基因同源物(resistancegeneshomologues，RGHs)开发的分子标记可能与目标基因紧密连锁，可以用来进行分子标记辅助选择(MarkerassistedSelection，MAS)与图位克隆。为了定位表达的RGHs，本文通过EST数据挖掘，得到了100条PR蛋白序列和215条RGAs并设计了347对特异引物。同时，从已发表的文献中搜集了61对根据棉花基因组DNA序列设计的RGA引物以及24对RGAP引物。利用这432对引物，最终将38个EST来源标记和17个基因组来源标记添加到本实验室已构建的棉花种间遗传图谱中。这55个标记分布在棉花26条染色体中的15条上，其中6条染色体(Chr03、Chr04、Chr11、Chr17、Chr19和Chr26)上包含有多达34个标记。在9条染色体上发现有RGHs标记紧密分布，其中较大的3个簇分布在Chr03、Chr04和Chr19上。这说明RGHs簇在棉花基因组上分布是非常广泛的。部分簇内成员是由高度同源序列组成的，这表明高度同源序列倾向于成簇分布。通过半定量RT-PCR发现19个标记在受黄萎病病菌V991诱导后表达水平剧烈变化。本实验结果表明EST来源的RGHs确实参与到了植物抗性反应，为进一步棉花抗病研究和抗病育种提供了有效的分子标记。

目录

声明

摘要

缩略词表

1 文献综述

1．1 植物抗病基因(R gene)

1．1．1 R基因的克隆

1．1．2 已克隆抗病基因的保守结构和分类

1．1．3 植物抗病基因结构及特点

1．1．4 抗病基因作用机制

1．2 病程相关蛋白

1．2．1 病程相关蛋白的定义和功能

1．2．2 病程相关蛋白的作用机理

1．2．3 病程相关蛋白PR10

1．3 抗病基因同源物(RGA)克隆方法及应用

1．3．1 RGA克隆方法

1．3．2 RGA的应用

1．4 研究意义和实验设计

1．4．1 研究意义

1．4．2 实验设计

2材料与方法

2．1 材料与RNA提取

2．2 数据挖掘及引物设计

2．2．1 PR序列挖掘及引物设计

2．2．2 RGA序列挖掘及引物设计

2．3收集文献中RGA引物

2．4 PCR扩增、SSCP分析及数据记录

2．4．1 PCR扩增

2．4．2 SSCP分析

2．4．3 数据记录方法

2．5 遗传图谱构建

2．6 半定量RT-PCR分析

3 实验结果

3．1 序列挖掘与引物设计

3．2 遗传图谱构建

3．2．1 扩增结果和遗传定位

3．2．2 RGHs在棉花基因组上分布规律

3．3 半定量RT-PCR分析

4 讨论

4．1 利用EST数据库挖掘RGHs的优势

4．1．1 部分克服假基因和表达水平的干扰

4．1．2 序列多态性高，类型丰富

4．2 RGHs在棉花基因组上的分布规律

4．2．1 RGHs在不同染色体上分布不均

4．2．2 RGHs数目在A，D亚基因组间分布

4．2．3 RGHs在棉花基因组上成簇分布

4．2．4 高同源序列倾向成簇分布

4．2．5 单个引物产生的多个标记定位在同源染色体上

4．3 表达分析

4．4 RGHs标记与黄萎病抗性相关标记连锁

4．5 结论

参考文献

致谢

附录