粪类圆线虫两个不同发育阶段microRNA转录组的鉴定

摘要

microRNA(miRNAs)是一类长度在18-24nt的非编码RNA。miRNA能通过与编码蛋白的mRNA互补或者部分互补从而抑制mRNA的翻译，对生物起到转录后调控作用。这种转录后调控涉及细胞分化凋亡、生长发育和基因表达等多种重要的生物学过程，而且在病毒、植物和动物中广泛的存在。尽管第一个miRNA(lin-4)在秀丽隐杆线虫中发现，其后在其他生物中也相继发现了几百个miRNAs，其中部分miRNAs的功能也逐渐被阐述，但是目前关于寄生虫miRNAs鉴定和分子机制的研究的报道却很少。寄生虫生活史复杂，有的寄生虫从幼虫发育至成虫甚至要改变多个宿主，这样就需要虫体快速地适应环境的变化。而具有转录后调控功能的miRNAs很可能在寄生虫的生命活动起着重要的调节作用。粪类圆线虫是一种重要的人畜共患寄生线虫，与大多数寄生线虫不同，它的生活史包括寄生世代和自由生活世代，因此被认为是很好的研究寄生生活的模式动物，但目前尚未见到有关该寄生线虫miRNAs研究的报道。
　　 本研究通过对粪类圆线虫的寄生后自由生活一期幼虫和具有感染能力的三期幼虫建立miRNA文库进行高通量测序，鉴定参与粪类圆线虫这两个不同发育时期的miRNAs并研究其差异表达。同时通过生物信息学方法对两个不同时期的总miRNAs进行靶点的预测。最后，鉴于目前寄生虫中的miRNAs研究较少，选取保守miRNAs利用分子生物学方法分析其在粪类圆线虫两个不同发育时期的表达状况。结果显示:
　　 1)粪类圆线虫两个不同时期幼虫文库的建立和高通量测序建立了粪类圆线虫两个不同发育时期幼虫的文库。高通量测序后，分别在粪类圆线虫的自由生活一期幼虫中获得了11，154，540 clean reads和1，570，666 uniquereads，具有感染能力的三期虫体中获得了11，571，267 clean reads和707，106 uniquereads。
　　 2) miRNAs数据的生物信息学分析两个文库中的小RNA分布主要集中在20-24nt;对小RNA数据处理后，粪类圆线虫两个时期中共获得15个保守miRNAs共17个miRNA前体、110个新miRNAs和113个潜在的miRNAs。在新miRNAs中，自由生活一期幼虫有3个特异表达的新miRNA;
　　 靶基因预测软件PicTar对所有的miRNAs预测共得到234个靶基因，通过GO分析发现这31个靶基因功能主要集中在连接、酶促和运输;生物学过程分类集中在细胞过程、生物调节、代谢过程和刺激反馈。比较分析发现:参与生物学调节、定位和色素沉积生物学过程的靶基因仅仅在具有感染能力的三期幼虫miRNAs中被预测，而与生命发展和死亡相关的预测靶基因只在寄生后自由生活一起幼虫的miRNAs中发现。
　　 通过对miRBase收录的物种的所有miRNAs分析显示，在粪类圆线虫中发现的15个保守miRNAs中miR-50、miR-72、miR-86、miR-236和miR-360仅仅在线虫中发现。miR-71、miR-79和miR-252在多个物种中发现，而miR-92、miR-124和miR-137基本上存在于miRBase收录的所有物种中。
　　 3)分子生物学方法验证粪类圆线虫中的miRNAs通过stemloop-PCR的方法在粪类圆线虫三期幼虫中克隆、测序了4个高度表达的保守miRNAs，测序结果显示在这4个miRNAs存在三期幼虫中。选取1个潜在的miRNA(Let-7)和3个保守miRNAs进行荧光定量PCR确定这些miRNAs在粪类圆线虫中两个不同时期幼虫中的相对表达情况，荧光定量结果与测序结果相同。
　　 本研究通过Solexa高通量测序技术对粪类圆线虫寄生后自由生活一期幼虫和具有感染能力的三期幼虫进行了miRNAs的鉴定。通过生物信息学软件对这些miRNAs的靶基因和功能进行了预测，并通过分子生物学方法验证了部分miRNAs。所获得的结果为粪类圆线虫的miRNAs的分子机制研究提供了信息和数据，并为进一步研究miRNAs成为可防控粪类圆线虫病的药物靶标奠定了基础。

目录

声明

摘要

缩略语表

1 文献综述

1．1 粪类圆线虫介绍

1．1．1 粪类圆线虫生活史

1．1．2 粪类圆线虫的危害

1．2 microRNAs介绍

1．2．1 microRNA的生成机制

1．2．2 microRNA的作用机制

1．2．3 microRNA的鉴定及研究方法

1．2．4 microRNA的功能研究

1．2．5 microRNA在寄生虫中的研究进展

2 研究的目的和意义

3 材料与方法

3．1 试验材料

3．1．1 试验动物

3．1．2 菌种和质粒

3．1．3 酶和主要试剂

3．1．4 主要溶液的配制

3．1．5 主要仪器和设备

3．2 试验方法

3．2．1 粪类圆线虫寄生后一期和感染期三期幼虫的总RNA的获取

3．2．2 粪类圆线虫寄生后一期和三期幼虫的小RNA文库建立和高通量测序

3．2．3 粪类圆线虫测序数据的原始处理

3．2．4 粪类圆线虫测序数据的特征分析

3．2．5 粪类圆线虫寄生后一期和三期幼虫的miRNA分析结果验证

4 结果与分析

4．1 粪类圆线虫ppL1和iL3的收集

4．2 粪类圆线虫ppL1和iL3的RNA提取

4．3 粪类圆线虫ppL1和iL3的RNA测序结果

4．3．1 测序数据概述

4．3．2 其他类型RNA的滤过

4．3．3 序列长度的分布统计

4．4 粪类圆线虫ppL1和iL3的测序数据的深度分析

4．4．1 粪类圆线虫测序数据分析

4．4．2 粪类圆线虫ppL1和iL3的miRNAs差异分析结果

4．4．3 stem-loop PCR对部分miRNAs表达结果验证

4．4．4 进化分析

4．4．5 靶基因预测

5 讨论

5．1 粪类圆线虫不同时期的测序质量

5．2 粪类圆线虫不同时期miRNAs长度的分布特征

5．3 粪类圆线虫保守miRNA作为分子进化标志的发掘

5．4 粪类圆线虫保守miRNA基因簇和miRNA

5．5 粪类圆线虫miRNA靶点分布

5．6 粪类圆线虫两个不同时期miRNA转录组表达差异

结论

参考文献

致谢

附录 作者简介

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