鸭源呼肠孤病毒致BHK-21细胞凋亡的研究

摘要

本试验采用细胞培养术、RT-PCR技术、光镜、电镜、荧光定量RT-PCR、TUNEL和流式细胞术等多种研究方法，对近几年来湖北省鸭源呼肠孤病毒分离株(DuckReovirus，DRV) JZ061214株、HP080421株、HP081122株、HP09318株和YM101120株感染BHK-21细胞后细胞的病理变化特点、基因结构特点、病毒增殖状况和诱导细胞凋亡情况等作了系统的研究。
　　 DRV感染BHK-21细胞的病理变化情况:攻毒后24h，细胞开始出现病变，表现为有的细胞圆缩，溶解、碎裂，攻毒48h后，病变逐渐加重，圆缩细胞越来越多，并可见悬浮的巨细胞，攻毒72h后，大量死亡细胞悬浮于培养液中。细胞经H.E染色，显微镜观察可见:部分细胞死亡，感染细胞核固缩、碎裂，且出现嗜酸性包涵体和合胞体。感染DRV的BHK-21被收集用来制作超薄切片，电镜下可观察到大小不一的空泡，同时，细胞质中呈现晶格状排列的病毒颗粒，病毒在细胞质增殖、复制，通过细胞崩解释放出来。
　　 DRV感染BHK-21后的增殖情况:于接种病毒后1～72h七个时间段分别进行收毒，用荧光定量RT-PCR法检测所获病毒含量。结果表明，HP080421株、YM101120株和JZ061214株于攻毒后1～12h病毒含量较低，且呈上升趋势;JZ061214株、HP080421株和HP09318株于攻毒后24～72h病毒含量亦呈上升趋势;4株DRV病毒含量均于攻毒后72h达到高峰。
　　 DRV感染BHK-21细胞后流式细胞仪检测细胞凋亡情况:HP09318和HP080421凋亡高峰出现在攻毒后3h，YM101120的凋亡高峰在攻毒后6h，而JZ061214出现在12h;它们的凋亡高峰时间有所不同，但均集中在攻毒后3～12h。且随着攻毒时间的延长，后期死亡细胞数呈增长趋势。
　　 DRV感染BHK-21细胞后TUNEL检测细胞凋亡结果:4株DRV均于攻毒后3h检测到了比对照组多的凋亡阳性细胞，这些细胞的核都被染成棕黄色，随着死亡细胞数的增加，凋亡的阳性细胞数递减。这一凋亡情况与流式细胞仪检测的结果基本一致。
　　 DRV S组基因扩增情况:对五株DRV S2、S3和S4基因进行扩增，分别扩增出1251bp、1104bp、1104bp的片段。测序结果通过进化树分析:五株分离株的S2基因与NP03和GZ/CHN/2007的遗传进化关系最近，分属同一分支，五株分离株的S3基因与GZ/CHN/2007遗传关系最近，分属同一分支，其中HP09318、HP081122、JZ061214、YM101120与HP080421属同一亚系;五株分离株的S4基因与GZ/CHN/2007遗传进化关系最近，分属同一进化分支;五株DRV S2基因之间的同源性高达98～100％，与DRVGZ/CHN/2007株同源性高达99％，与MDRV S12株同源性高达95％，与GRV03G株同源性高达97％，与所有ARV毒株的同源性都低，范围在77％～78％间;五株DRV S3基因之间的同源性为98～100％，与DRV NP03株同源性高达99％，与DRV091株同源性高达98％，与GZ/CHN/2007同源性高达97％，与MDRV03G株同源性高达95％，与ARV毒株的同源性也较低;五株DRVS4基因之间的同源性类似于S2基因的表现情况。

目录

声明

摘要

缩略词表

本研究所用呼肠孤病毒参考毒株序列

前言

1 禽呼肠孤病毒(ARV)病概述

1．1 呼肠孤病毒病

1．2 流行病学

1．3 鸡呼肠孤病毒感染

1．4 鸭呼肠孤病毒感染

2 禽呼肠孤病毒

2．1 呼肠孤病毒的形态特点

2．2 病毒对细胞的致病性

2．3 病毒的基因组结构

3 呼肠孤病毒与细胞凋亡

本研究的目的与意义

材料与方法

1 材料

1．1 病毒

1．2 细胞

1．3 参考序列

1．4 主要实验耗材

1．5 主要仪器设备

1．6 主要溶液及其配制

2 方法

2．1 BHK-21细胞的传代培养

2．2 DRV病毒的接种和增殖

2．3 DRV病毒致BHK-21细胞的病变

2．4 TUNEL法染色检测细胞凋亡

2．5 鸭源呼肠孤病毒致BHK-21细胞的超微病变及观察

2．6 实时荧光定量RT-PCR检测DRV感染后BHK-21细胞和其培养液混合物中的病毒含量

2．7 流式细胞仪对4株DRV攻毒后BHK-21细胞凋亡的检测

2．8 DRV S组基因的扩增

2．9 产物的回收和纯化

2．10 产物连接和转化

2．11 菌液PCR鉴定

2．12 序列分析

3 数据统计与处理

结果与分析

1 病毒致BHK-21细胞的病理变化观察

1．1 倒置显微镜下观察细胞的形态

1．2 光镜下观察细胞病变

1．3 鸭源呼肠孤病毒致BHK-21细胞的超微病变

2 实时荧光定量RT-PCR检测DRV感染后BHK-21细胞和其培养液混合物中的病毒含量

3 BHK-21细胞感染DRV后，应用流式细胞仪进行细胞凋亡检测结果

4 BHK-21细胞感染DRV后，应用TUNEL进行细胞凋亡检测的结果

5 DRV S基因组的扩增结果及序列分析

5．1 DRV S基因组的扩增

5．2 DRV S组基因序列分析

讨论

1 DRV致BHK-21细胞病变特点

2 各株DRV细胞凋亡与病毒增殖特点

3 DRV S组基因分析

结论

参考文献

致谢