宏基因组文库筛选猪场土壤氟苯尼考抗性基因

摘要

近年来兽药抗生素在畜禽养殖中大量使用。大部分抗生素未经代谢以母体化合物形式随粪便排出体外，并以粪肥的形式施入土壤，导致抗生素在土壤中积累，由此可能会诱导抗性微生物和抗生素抗性基因(ARGs)的产生，对人畜健康构成极大的潜在威胁。
　　 本文选取长期使用氟苯尼考的养猪场为采样点，通过宏基因组学方法对土壤中的氟苯尼考抗性基因进行了筛选，主要获得了以下结果：⑴提取猪场土壤总DNA，利用限制性内切酶XhoⅠ和PstⅠ对基因组DNA进行双酶切，分别回收4-7 kb和2.5-4 kb片段。以pUC18质粒为载体，将双酶切后的DNA片段转化进宿主菌—E.coli BL21，构建了包含约2.5万个大片段克隆子和约1.5万个小片段克隆子的土壤宏基因组文库。⑵对获取的文库进行氟苯尼考抗性功能筛选，得到了约300个阳性克隆子。对其中的2株阳性克隆子进行插入片段测序，通过序列分析发现，其中一个片段含有一个编码转录调控激活因子SdiA的基因，该基因存在于多种大肠杆菌菌株中，主要参与AcrAB-TolC外排泵的正向表达调控，从而实现大肠杆菌的多重耐药性功能。另外一个片段包含一个未知的ORF以及3个目前已经被鉴定出的基因—编码Methylobacterium中反应调节受体蛋白的基因，编码Oligotropha carboxidovoransOM5菌株中异化扩散蛋白超家族(MFS)(Bcr/Clf亚族)的基因，编码Xanthobacterautotrophicus Py2菌株中短链脱氢酶SDR的基因，与这些基因的相似性都达到75％左右，其中的MFS蛋白具有质子泵功能，可以通过把抗生素排出细胞从而使细菌具有耐药性。本研究在国内首次通过构建宏基因组文库的方法成功筛选出猪场土壤中氟苯尼考的重组抗性菌株。对抗生素抗性基因的筛选，有助于深入了解环境中抗性基因的产生和传播途径，客观评价抗生素在环境中的生态风险。

目录

声明

摘要

缩略词(Abbreviation)

1 前言

1．1 抗生素简介

1．1．1 抗生素种类及作用机理

1．1．2 抗生素使用情况介绍

1．1．3 抗生素的环境影响

1．1．4 氟苯尼考简介

1．2 抗性基因研究背景

1．2．1 细菌耐药机制

1．2．2 ARGs及其在环境中的传播

1．2．3 环境中ARGs的筛选方法

1．3 宏基因组学概述

1．3．1 宏基因组学研究策略

1．3．2 宏基因组学在土壤活性物质开发中的应用

1．4 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 土壤样品来源

2．1．2 菌种与质粒

2．1．3 主要试剂

2．1．4 培养基

2．1．5 仪器

2．1．6 常用溶液

2．2 试验方法

2．2．1 土壤宏基因组文库的构建

2．2．2 氟苯尼考抗性基因的筛选与鉴定

3 结果与分析

3．1 土壤宏基因组文库的构建

3．1．1 DNA的提取和纯化

3．1．2 基因组DNA的双酶切

3．1．3 质粒的制备与酶切

3．1．4 质粒自连实验

3．1．5 文库的构建

3．1．6 文库的质粒验证

3．2 氟苯尼考抗性基因的筛选与鉴定

3．2．1 文库的抗性筛选

3．2．2 质粒的抗性验证

3．2．3 连接片段大小验证

3．2．4 插入片段的生物信息学分析

4 讨论

4．1 土壤宏基因组文库的构建

4．2 克隆文库的筛选

4．3 本研究创新点

4．4 研究展望

参考文献

致谢

附录