一种用于A型鸭甲肝病毒检测的类病毒颗粒制备

摘要

鸭病毒性肝炎(Duck Viral Hepatitis，DVH)是雏鸭的一种急性致死性疾病，以肝炎和高死亡率为主要特征，病原是鸭肝炎病毒(Duck Hepatitis Virus，DHV)。我国流行的鸭肝炎以A型鸭甲肝病毒(Duck Hepatitis AVirus，DHAV-1)为主。DHAV-1由于个体很小，纯化较为困难。通过杆状病毒表达系统制备DHAV-1类病毒颗粒(virus-like particle，VLP)，可以更方便的获得病毒人工抗原，通过纯化，可将其用于DHAV-1的检测，以辅助该病的预防和控制工作，亦可作为潜在的候选疫苗或以此为抗原制备单克隆抗体建立免疫学诊断方法奠定基础。
　　 小RNA病毒(Picomavirus)病毒衣壳具有相似的组装模式，以3CD蛋白水解酶将P1结构蛋白前蛋白切割成单一的结构蛋白再组装而成。本实验根据DHV-1 JX株基因组序列，设计含有BamHⅠ和SalⅠ酶切位点的P1基因引物，含有XhoⅠ和KpnⅠ酶切位点的3CD基因引物，以JX株RNA为模板，RT-PCR扩增P1和3CD基因。随后运用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统，将DHAV-1的3CD水解酶与P1多聚蛋白基因放入同一个重组杆状病毒(vBac-P1-3CD)中，利用单一感染的方式同时表达两种蛋白来产生类病毒颗粒。利用电镜观察感染细胞的超薄切片，发现细胞内有类病毒颗粒堆积，颗粒大小35-40nm，再结合蔗糖不连续密度梯度离心的超速离心后，获得类病毒颗粒，负染后电镜观察，确认颗粒主要以两种形式存在，一种是直径40-60nm的大小形态不均一的球形颗粒，一种是结构均一的直径27nm左右的球形颗粒，并通过Western blot分析类病毒颗粒的组成，最终证实这些颗粒为DHAV-1类病毒颗粒，即成功制备DHAV-1类病毒颗粒。
　　 综上所述，本研究利用杆状病毒表达系统成功制备DHAV-1类病毒颗粒，且DHAV-1类病毒颗粒可与特异性抗体发生反应，证明其可成为一种用于DHAV-1检测的抗原。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 文献综述

1 DHAV概述

1．1 DHAV的流行现状

1．2 DHAV-1的分类地位

1．3 DHAV的病原学特性

1．4 DHAV的纯化

1．5 DHAV病原检测

2 类病毒颗粒的研究概述

2．1 小RNA病毒VLP组装研究

2．2 VLP的应用

3 杆状病毒表达系统

4 本研究的目的与意义

第二章 重组杆状病毒vBac-P1-3CD的获得及DHAV-1病毒样颗粒的表达

1 实验材料

1．1 毒株、菌株、质粒及细胞

1．2 主要试剂

1．3 培养基

2 试验方法

2．1 P1、3CD基因的引物设计与合成

2．2 P1和3CD基因的克隆

2．3 构建供体质粒pFastBac Dual-P1-3CD

2．4 构建穿梭质粒Bacmid-P1-3CD

2．5 重组杆状病毒vBac-P1-3CD的获得

2．6 DHAV-1类病毒颗粒的鉴定

3 试验结果

3．1 P1、3CD基因的克隆

3．2 pFastBac Dual-P1-3CD质粒的构建

3．3 穿梭质粒Bacmid-P1-3CD的构建

3．4 重组杆状病毒的获得

3．5 感染细胞的超薄切片观察

3．6 重组蛋白的表达

3．7 DHAV-1 VLP的纯化及观察

4 讨论

4．1 重组杆状病毒的构建

4．2 VLP的形成及特性分析

5 结论

参考文献

致谢