胰腺炎型鸭1型甲肝病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备

摘要

本试验病原为胰腺炎型 DHAV-1(MPZJ1206株)，其所引起的病变与典型的DHAV-1有所不同，主要引起雏番鸭发生病变，发病的雏番鸭胰腺可见发黄和出血?将胰腺炎型DHAV-1与GenBank中登录的DHAV-1相比，发现其VP1基因核苷酸同源性在94.1％与99.1%之间，VP1基因推导氨基酸残基的同源性在96.8%与97.5%之间。
　　本实验根据MPZJ1206株的VP1基因设计一对特异性引物，并采用RT-PCR法将目的VP1基因扩增，扩增产物回收纯化后，将其连接到克隆载体pMD18-T上，构建克隆载体pMD18-T-VP1，并将其转化到感受态细胞E.coli Trans5α。挑取单菌落，双酶切鉴定并测序，将鉴定为阳性的菌落提取质粒进行双酶切，回收VP1片段，将其与表达载体 pGEX-6P-1进行连接。并将连接产物转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中，鉴定同上，将鉴定为阳性的菌落经IPTG诱导后，进行SDS-PAGE电泳，并对其进行了鉴定。在此基础上对VP1蛋白的表达条件进行了优化。结果表明，表达的目的蛋白大小为53kDa，与预期相符，且具有反应原性，37℃诱导表达5h蛋白表达量达到最大，主要以包涵体的形式存在。
　　将诱导表达的VP1蛋白作为抗原免疫BALB/C小鼠，共免疫四次。同时建立检测小鼠抗VP1抗体的间接ELISA检测方法。最后一次免疫后72h内取处于对数期生长的SP2/0骨髓瘤细胞与免疫小鼠脾细胞进行融合。融合后的杂交瘤细胞采用间接ELISA筛选阳性克隆，并进行亚克隆，结果共获得的2株杂交瘤细胞株均能稳定分泌抗DHAV-1的VP1蛋白单克隆抗体，分别命名为1A2、5G3，并对其稳定性，小鼠腹水的效价等进行检测?
　　本实验表明，两株单克隆抗体具有稳定性好，效价较高，特异性良好的特点。1A2株效价可达1：25×103，5G3株效价可达1：211×103。亚类鉴定结果显示，两株细胞均为IgG1、κ链抗体。Western-blot表明两株单克隆抗体是针对DHAV-1的VP1蛋白?本实验获得的单克隆抗体为DHAV-1的治疗以及研制试剂盒对其进行检测打下了基础。

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1 前言

1.1 DHAV-1的流行特点及分布情况

1.2 鸭1型甲肝病毒的理化特性及生物学特性

1.3 鸭1型甲型肝炎病毒的特性和基因组结构

1.3.1 鸭1型甲肝病毒非编码区

1.3.2 鸭1型甲肝病毒编码区

1.4 鸭1型甲肝病毒的检测方法

1.4.1 中和试验

1.4.2 HA和HI试验

1.4.3 ELISA试验

1.4.4 荧光抗体法

1.4.5 胶体金法

1.4.6 RT-PCR技术

1.4.7 PCR-DHPLC

1.4.8 RT-LAMP

1.5 单克隆抗体技术

1.6 小结

2. 胰腺炎型DHAV-1的VP1基因的原核表达及鉴定

2.1 实验材料及试剂

2.1.1 实验病毒及试剂

2.1.2 常用溶液的配置

2.1.3 实验仪器

2.2 实验方法

2.2.1 引物设计

2.2.2 目的基因的PCR扩增

2.2.3 PCR产物的回收与克隆

2.2.4 VP1重组蛋白的诱导表达条件的优化

2.2.5 VP1蛋白的可溶性分析

2.2.6 VP1蛋白的Western-blot鉴定

2.3 实验结果

2.3.1 VP1蛋白抗原表位的预测及序列分析

2.3.2 VP1基因的PCR扩增及双酶切鉴定

2.3.3 VP1蛋白表达条件的优化

2.3.4 VP1蛋白的可溶性分析结果

2.3.5 胰腺炎型鸭1型甲肝病毒VP1蛋白的Western-blot检测

2.4 讨论

3.胰腺炎型鸭1型甲肝病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备

3.1 实验材料及试剂

3.1.1 实验细胞及动物

3.1.2 主要试剂

3.1.3 实验用液

3.1.4 仪器设备

3.2 单克隆抗体的制备

3.2.1 小鼠的免疫

3.2.2 胰腺炎型DHAV-1抗体的间接ELISA检测方法的建立

3.2.3 饲养层细胞的制备

3.2.4 骨髓瘤细胞的准备

3.2.5 脾细胞的制备

3.2.6 细胞融合

3.2.7 阳性杂交瘤细胞的克隆

3.2.8 杂交瘤细胞的冻存和复苏

3.2.9 杂交瘤细胞的鉴定

3.2.10 单克隆抗体腹水制备

3.2.11 单克隆抗体腹水效价测定

3.3 结果与分析

3.3.1 检测胰腺炎型DHAV-1抗体的间接ELISA的建立

3.3.2 杂交瘤细胞株的建立

3.3.3 稳定性鉴定结果

3.3.4 杂交瘤细胞的扩大培养

3.3.5 Western-blot鉴定结果

3.3.5 单克隆抗体的鉴定结果

3.4 讨论

3.4.1 抗原的选择与制备

3.4.2 免疫动物的选择

3.4.3 免疫程序的确定

3.4.4 饲养细胞

3.4.5 细胞融合

3.4.6 单克隆抗体效价比较

4结论

参考文献

附录

致谢