T-2毒素抑制GH3细胞生长激素合成与分泌的基因组和蛋白组研究

摘要

T-2毒素属于单端孢霉烯族化合物，是这类毒素中毒性最强的一种，是污染饲料的主要的霉菌毒素，对人、畜禽健康和畜牧业生产造成严重的危害。急性暴露单端孢毒素可导致呕吐和腹泻，长期暴露可致机体厌食，抑制生长，造成内分泌系统和免疫系统等损伤严重。动物实验结果发现，T-2毒素的靶器官之一是动物的脑垂体，实验室前期研究表明，T-2毒素可以抑制大鼠垂体瘤GH3细胞生长激素的分泌，生长激素对于脊椎动物的生长调控起重要作用。目前，T-2毒素对动物生长抑制机制的研究并不深入，其影响生长激素的合成和分泌机制并未得到很好的揭示。现今，基因组和蛋白组学技术已成为研究毒理作用机理和寻找靶点的新手段。鉴于T-2毒素抑制生长毒性的重要性，本研究选择中低剂量(10nM和40 nM)的T-2毒素暴露大鼠垂体瘤GH3细胞为实验材料，运用安捷伦大鼠44 K基因芯片和双向电泳-质谱鉴定技术相结合，筛选T-2毒素作用于GH3细胞后的差异基因和差异蛋白，分析与抑制生长毒性作用相关的基因、蛋白及抑制生长激素合成与分泌的分子机制。为今后国内外T-2毒素的研究提供参考，进而为食品安全和控制靶点提供科学依据。
　　 1.毒素的选择和毒素作用时间和浓度的确定
　　 文献及实验室前期研究表明，T-2毒素是单端孢毒素中毒性最强的，因此本研究只需比较T-2毒素和代谢产物的毒性大小。采用MTT实验检测T-2毒素及代谢物(5-80nM)作用于GH3细胞株12h后细胞活力的影响，结果发现，T-2毒素抑制GH3细胞活力的毒性最强，并表现出浓度依赖性的毒性效应，因此选择T-2毒素作为后续实验的化合物，对于探讨单端孢毒素的生长毒性机制研究更有意义。
　　 为了确定与毒素作用直接相关的基因和蛋白质以及毒素浓度与基因变化之间的剂量关系，本研究使用ELISA方法检测T-2毒素(5-80 nM)作用于GH3细胞12 h后生长激素的合成与分泌量。结果表明，T-2毒素能显著抑制GH的合成和分泌并呈现浓度依赖性，10nM和40 nM T-2毒素抑制生长激素的结果:GH分泌分别为90.45％±4.32和88.67％±3.57，GH合成分别为185.23％±3.47和170.17％±2.1，统计学分析呈差异显著。在不影响细胞活力且能抑制生长激素的合成和分泌前提下，最终确定的作用时间为12h，作用浓度为10 nM和40 nM。
　　 2.T-2毒素作用GH3细胞后的差异表达基因
　　 为了研究T-2毒素抑制GH合成与分泌的分子机制，按照上述结果及相关文献，选择10nM和40 nM的T-2毒素处理GH3细胞12h作为两个不同的毒素处理组，未处理的GH3细胞作为空白对照组，利用安捷伦芯片筛选毒素作用后的差异基因，并对差异基因进行功能分类。
　　 基因芯片结果显示10nM T-2毒素组与空白组相比有1044个下调差异基因（已知名称和功能的基因有877个），1408个上调差异基因（已知名称和功能的基因有1261个）;40 nM T-2毒素组与空白组相比有1610个下调差异基因（已知名称和功能的基因有1194个），1736个上调差异基因（已知名称和功能的基因有1541个），呈现剂量-效应明确。这些差异基因涉及能量代谢、转录调控、细胞应激反应、转运、氧化还原等多个生物学过程。分析相关基因的功能，推测半胱氨酰-tRNA合酶、天冬氨酰-tRNA合酶及核糖体应激信号通路可能是T-2毒素抑制GH合成的重要分子靶点。另外，T-2毒素下调与能量代谢相关的基因，干扰细胞内的能量代谢，造成生长激素合成和分泌过程中能量不足，进而造成生长激素的含量降低。用荧光定量PCR验证了基因Ergic2、Nqo1、Snap25、HCK、PKR和caspase3，结果表明上述基因mRNA表达与芯片变化趋势一致，说明这些基因可能参与了T-2毒素影响生长激素分泌合成的过程。
　　 3.T-2毒素作用GH3细胞后的差异表达蛋白
　　 为了从蛋白水平同步探究T-2毒素抑制生长激素合成和分泌的机制，运用双向电泳-质谱鉴定相结合的技术，研究T-2毒素暴露大鼠垂体瘤细胞12h、24 h的蛋白表达谱变化，采用MALDI-TOF MS/MS生物质谱技术进行鉴定，成功鉴定的蛋白:T-2处理GH3细胞12 h有91个差异蛋白，30个上调蛋白和61个下调蛋白;24h共鉴定63个差异蛋白，上调蛋白25个和下调蛋白38个。采用Gene Ontology、KEGG等生物信息学软件分析发现它们主要参与能量代谢、应激反应、转录与翻译、信号转导等生物学功能。大量能量代谢中的酶类表达水平发生改变，如丙酮酸激酶、异柠檬酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶等，揭示T-2毒素影响了GH3细胞内正常的能量代谢过程，进而影响GH的合成与分泌过程。二硫键异构酶在GH的合成过程中起关键作用，T-2毒素作用后其表达下调，直接影响GH的合成。另外，细胞骨架蛋白(Coficin-1、TBA1C、Actin)、钙调蛋白和氧化还原蛋白等其他蛋白可能协同影响T-2毒素抑制GH的合成与分泌过程。生长激素作为本研究的目的蛋白，GRP78蛋白帮助GH的正确折叠，在T-2毒素作用后变化显著，因此本研究采用Western blot方法验证了GH和GRP78蛋白的表达，结果与双向电泳结果一致。
　　 基于基因和蛋白的整体分析，T-2毒素抑制生长激素合成分泌的毒性机制可能是:正常的GH3细胞具有分泌功能且蛋白质合成旺盛，T-2毒素作用于GH3细胞后激活PKR和HCK激酶，诱发核糖体应激反应，激活JNK通路，导致凋亡反应的发生。同时发现氨酰-tRNA合酶降低、蛋白二硫键异构酶(PDI)表达下调，从而抑制GH的合成。T-2毒素激活内质网应激晚期反应，新发现的ER的感受器Creb311基因下调表达，内质网分子伴侣蛋白下调表达，从而导致错误折叠的GH蛋白不能正确折叠而被降解，导致GH3细胞内GH含量降低。T-2毒素干扰了囊泡的转运过程，降低了GH的分泌。T-2毒素降低细胞内能量代谢过程，干扰了GH合成和分泌过程，进一步影响了生长激素的合成与分泌。

目录

论文说明

声明

摘要

缩略语表

1 前言

1．1 立题依据

1．2 国内外研究现状与发展趋势

1．2．1 T-2毒素的化学组成及危害

1．2．2 单端孢毒素抑制生长的机理

1．2．3 T-2毒素毒性机制的研究方法

1．3 目的意义

2 材料与方法

2．1 细胞株

2．2 主要试剂

2．3 主要仪器设备

2．4 主要溶液的配制

2．5 细胞培养及冻存

2．6 MTT筛选对GH3细胞毒性最大的单端孢毒素

2．7 毒素作用合适浓度和时间测定(ELISA方法检测生长激素浓度)

2．7．1 待测样本准备

2．7．2 操作步骤

2．8 毒素作用差异基因的检测(基因芯片)

2．8．1 样品RNA的抽提(TRIZOL法)

2．8．2 cDNA第一链和第二链一步法合成

2．8．3 荧光标记cRNA合成

2．8．4 荧光探针纯化

2．8．5 芯片杂交

2．8．6 芯片洗涤

2．8．7 芯片扫描及数据分析

2．8．8 部分差异基因验证(Real-Time PCR)

2．9 GH3细胞蛋白质二维电泳条件优化及质谱鉴定

2．9．1 细胞处理及分组

2．9．2 GH3细胞蛋白提取方法

2．9．3 蛋白质定量

2．9．4 二维凝胶电泳

2．9．5 图像扫描及分析

2．9．6 蛋白质质谱鉴定

2．9．7 Western Blot方法验证GH和GRP78蛋白表达情况

3 结果与分析

3．1 T-2毒素作用于GH3细胞的毒性最大

3．2 T-2毒素作用合适浓度和时间确定

3．2．1 细胞生存活力的检测

3．2．2 T-2毒素对GH3细胞GH分泌的影响

3．3 T-2作用差异基因的分析(基因芯片)

3．3．1 总RNA质量

3．3．2 芯片质量与结果可靠性分析

3．3．3 毒素作用后差异表达基因

3．3．4 关键基因mRNA表达水平的验证

3．4 T-2毒素作用GH3细胞的差异蛋白分析(双向电泳-质谱)

3．4．1 双向电泳条件的优化

3．4．2 T-2处理GH3细胞的2D图谱

3．4．3 T-2处理GH3细胞2D图谱分析

3．4．4 差异蛋白点的鉴定分析

3．4．5 Western Blot验证GH和BIP蛋白

3．5 基因芯片结果与蛋白组的比对

4 讨论

4．1 T-2毒素作用GH3细胞浓度和时间的确定

4．2 T-2毒素对GH3细胞GH合成分泌的影响

4．2．1 生长激素合成的相关基因和蛋白

4．2．2 生长激素加工相关的基因与蛋白

4．2．3 间接影响GH合成加工的基因与蛋白

4．2．4 生长激素分泌相关基因与蛋白

4．2．5 能量代谢相关基因与蛋白

4．3 T-2毒素作用于GH3细胞的时间关系

4．4 基因芯片与蛋白组学结果之间的关系

5 全文总结

文献综述：毒理基因组和蛋白质组的研究状况及发展前景

参考文献

致谢

附录