应用PCR法检测生物制品中支原体污染

摘要

支原体(Mycoplasma)是一类缺乏细胞壁的最小原核细胞型微生物，它结构简单，大小介于病毒和细菌之间。自1956年第一次检测到细胞培养物中存在支原体污染以来，支原体污染细胞培养物这个世界性问题持续了半个多世纪，兽用活疫苗中存在支原体污染的事例同样屡见不鲜，严重影响了疫苗的纯净性，降低疫苗的质量进而引发支原体感染，给畜牧业及疫苗生产企业带来巨大的经济损失。为了预防及控制支原体污染，减少支原体污染带来的危害，各种检测技术被应用到支原体污染的检测领域中，各国相继建立了支原体的检测方法。我国对支原体污染的研究工作起步较晚，支原体污染的检测技术有待改进。
　　 为了完善生物制品中支原体污染的检测技术，本研究针对口腔支原体(Ora)、精氨酸支原体(Arg)、发酵支原体(Fer)、莱氏无胆甾原体(Ala)、猪鼻支原体(Mho)、猪肺炎支原体(Mhp)、鸡毒支原体(Mg)、牛支原体(Mbo)、衣阿华支原体(Mi)、滑液支原体(Ms)、絮状支原体(Mf)、火鸡支原体(Mm)、鸡支原体(Gal)、鸭支原体(Ma)，共计14种污染生物制品的常见支原体设计引物，建立PCR检测方法，并应用此方法对多种生物制品进行检测。主要试验结果如下:
　　 1.生物制品中支原体污染的PCR检测方法的建立对14种支原体标准株的基因组序列进行分析，自行设计出一对可以检测这14种支原体的通用引物，同时培养这14种支原体，获取DNA模板，进行PCR扩增反应。结果显示14个模板均有目的片段，且片段大小在440bp～467bp之间，以此建立生物制品中支原体污染的PCR检测方法，扩大污染生物制品的支原体检测范围。
　　 2.生物制品中支原体污染的PCR检测方法的敏感性及特异性试验使用颜色变化单位法（CCU法）检测出8种支原体培养物的浓度后，对已建立的PCR检测方法进行敏感性试验。结果显示，此方法可以检测到8种支原体的最小浓度在1CCU～10CCU之间;在特异性试验中，选取各类细菌及病毒14种作对照，结果14种对照均不发生扩增反应。试验结果说明此PCR检测方法敏感性良好，特异性强。
　　 3.生物制品中支原体污染的PCR检测方法的应用应用此方法对10种兽用活疫苗中71个批次的样品和11种细胞系的24份传代细胞样品进行支原体污染检测，结果有3份疫苗样品为阳性、6份细胞样品为阳性。在对比其他支原体污染的检测方法中，已建立的PCR检测方法与培养法、DNA荧光染色法的检测结果均相同，但商品化支原体PCR检测试剂盒主要针对污染细胞的5种支原体有扩增反应，其检测结果是2份疫苗样品为阳性、6份细胞样品为阳性，产生漏检现象。试验结果说明此PCR检测方法的检测结果准确性高，避免出现漏检现象，有较好的应用前景。

目录

声明

摘要

缩略语(Abbreviation)

第一章 引言

1 支原体的概述

1．1 支原体的发展历史

1．2 支原体的形态与结构

1．3 支原体的微生态学

1．4 动物支原体病

1．5 支原体的培养

1．6 支原体对细胞培养的污染

1．7 支原体对兽用活疫苗的污染

2 支原体污染的检测及鉴定方法

2．1 分离培养法

2．2 DNA荧光染色法

2．3 核酸杂交技术

2．4 PCR技术

2．5 间接免疫荧光试验(IFA)

2．6 酶联免疫吸附试验(ELISA)

2．7 表面免疫荧光技术

2．8 生长抑制试验(GIT)

2．9 代谢抑制试验(MIT)

3 预防及清除污染细胞的支原体

3．1 细胞污染支原体的预防

3．2 细胞污染支原体的清除

4 研究的目的及意义

第二章 生物制品中支原体污染的PCR检测方法的建立

1 材料

1．1 菌株及病毒株

1．2 主要试剂

1．3 培养基及其配置

1．4 主要仪器

2 方法

2．1 引物设计

2．2 支原体培养

2．3 支原体菌液浓度测定试验

2．4 支原体核酸的抽提及其浓度的测定

2．5 病毒核酸的抽提

2．6 PCR扩增反应

2．7 PCR扩增反应的特异性试验

2．8 PCR扩增反应的敏感性试验

3 结果

3．1 支原体培养物及其核酸的浓度测定结果

3．2 PCR扩增反应的结果

3．3 PCR扩增反应的特异性试验结果

3．4 PCR扩增反应的敏感性试验结果

4 讨论

5 小结

第三章 生物制品中支原体污染的PCR检测方法的应用

1 材料

1．1 菌株

1．2 主要试剂

1．3 培养基及其配置

1．4 主要仪器

1．5 细胞及疫苗样品

2 方法

2．1 细胞样品的准备

2．2 疫苗样品的准备

2．3 PCR模板的准备

2．4 PCR方法检测细胞及疫苗样品

2．5 培养法检测细胞及疫苗样品

2．6 DNA荧光染色法检测细胞样品

2．7 DNA荧光染色法检测疫苗样品

3 结果

3．1 PCR方法检测细胞及疫苗样品的结果

3．2 商品化支原体检测试剂盒检测细胞及疫苗样品的结果

3．3 分离培养法检测细胞及疫苗样品的结果

3．4 DNA荧光染色法检测细胞及疫苗样品的结果

3．5 四种方法的检测结果对比

4 讨论

5 小结

参考文献

致谢