低氧胁迫下鲢微管蛋白相关基因及热休克蛋白70的表达分析

摘要

本文以鲢（Hypophthalmichthys molitrix）为研究对象，开展了其微管蛋白(Microtubulin)相关基因(TUB84和TUBA2)及诱导型热休克蛋白70(heat shock protein70,HSP70)的克隆，组织表达以及低氧胁迫过程中这三个基因在鲢心脏、脑、肝脏、脾、肾脏、肌肉中的表达分析。同时我们检测了HSP70和组成型热休克蛋白70(heatshock cognate protein70，HSC70)在鲢上述这些组织中的蛋白表达变化以及在窒息后拯救过程中脑中HSP70的表达变化。实验结果如下:
　　 1.TUB84和TUBA2的基因克隆及低氧胁迫下的表达分析
　　 采用同源克隆和RACE技术获得了鲢α微管蛋白的两个基因亚型的cDNA全长序列，分别命名为TUB84和TUBA2。TUB84基因全长1490bp，5'非编码区453bp，3'非编码区143bp，最大开放阅读框894bp，编码297个氨基酸;TUBA2基因全长1815bp，5(')非编码区105bp，3'端703bp，最大开放阅读框1007bp，编码449个氨基酸;氨基酸序列同源一致性比对结果显示，鲢TUB84和TUBA2与斑马鱼氨基酸序列同源一致性最高，分别为98％、97％。
　　 利用RT-PCR方法检测了TUB84和TUBA2两个基因在鲢的心脏、脑、肝脏、脾、肾、鳃、肌肉等组织中的表达分布情况，结果表明这两个基因在鲢的这7个组织中均有分布，且表达差异不显著。Real-time PCR检测结果显示，低氧胁迫2h，TUBA2的基因表达仅在心脏中略有升高，但不显著(P＞0.05)，在其他组织中没有明显变化，而TUB84在各个组织中都没有明显变化;低氧胁迫4h，TUB84在心脏中表达明显下降(P＜0.05)，在脑中略有升高但不显著(P＞0.05)，在其他组织中无明显变化，而TUBA2在脑、肌肉、心脏中表达都有所增加但不显著(P＜0.05);低氧胁迫6h，TUB84在肝脏、肾、肌肉中表达明显上升(P＜0.05)，在脾脏和脑中表达增加不明显(P＞0.05)，在心脏中表达显著下降(P＜0.05)，而TUBA2则在肝脏、脾脏和肾中表达明显升高(P＜0.05)，在心脏中出现显著下降(P＜0.05)，在脑和肌肉中无明显变化;低氧胁迫8h，TUB84除了在肾脏中有明显升高外(P＜0.05)，在其他组织中均无明显变化，TUBA2除了在肝脏和肾中明显升高外(P＜0.05)，在其他组织中也无明显变化;低氧胁迫10h，TUB84在肾中表达减少至正常水平，在脾脏中有所增加(P＜0.05)，在其他组织中无明显变化，而TUBA2在肝脏和肾中都明显减少，但在肝脏中仍高于正常水平，在肾中显著低于正常水平(P＜0.05)，在其他组织中无明显变化。由此可知，本研究中获得的两个微管蛋白基因TUB84和TUBA2的表达受低氧应激的调节。
　　 2.鲢诱导型HSP70 cDNA的克隆及表达分析
　　 采用同源克隆和cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends，RACE)扩增鲢HSP70基因的全长cDNA;以DNA为模板进行PCR扩增该序列的编码区验证其是否含有内含子;分别利用RT-PCR和Real-time PCR法检测HSP70mRNA在鲢各个组织中的分布情况及在急性低氧胁迫下其在脑组织中的表达变化。实验结果克隆得到鲢HSP70全长cDNA，全长为2339bp，包括67bp的5'非编码区，1932bp的编码643个氨基酸的阅读框和340bp的3'非编码区;基因组PCR扩增证实该基因不含内含子。
　　 半定量RT-PCR检测结果显示鲢HSP70基因在心脏、脑中表达量较高，在肝脏、肌肉、肾脏、脾中表达量较低。Real-time PCR结果表明，低氧胁迫过程中HSP70mRNA在各个组织中的表达量呈现出不同程度的变化趋势:在心脏中呈现出先升高后下降的表达趋势，低氧胁迫4h表达量达最高，10h时仍显著高于正常水平(P＜0.05);在脑中总体呈升高的趋势，虽在10h有所下降，但仍显著高于对照组(P＜0.05);在脾脏和肾中也呈现出升高的表达趋势，且均在低氧胁迫10h达到最大值;而在肌肉中则出现前期无明显变化，10h表达明显升高，且显著高于对照组(P＜0.05);在肝脏中的表达呈现波动性变化，4h表达量显著增加(P＜0.05)，而在6h降到了正常水平，随后又出现表达上调，10h达到最大值。由此可知，鲢HSP70的基因表达受低氧应激的调节，而HSP70 mRNA在各个组织中的表达上调可能是鲢应对低氧胁迫时的应激机制。
　　 3.低氧胁迫下两种热休克蛋白70的表达变化
　　 ELISA检测结果表明，低氧胁迫过程中HSC70在鲢各个组织中表达没有明显变化，而HSP70在鲢各个组织中呈现不同的表达趋势。肝脏中HSP70的表达呈波动性变化，除了6h低于正常水平外均显著高于正常水平(P＜0.05);心脏中HSP70的表达呈现先上升后下降的表达趋势，4h达到最大值;脑中HSP70的表达总体呈现出升高的趋势，虽在10h有所下降，但仍显著高于对照组(P＜0.05);在脾脏和肌肉中，低氧胁迫8h才出现明显的升高;在肾中，HSP70的表达呈现出波动性变化，4h表达显著低于正常水平，随后升高，8h达到最高值，10h表达又出现下降，但仍高于正常水平。
　　 对窒息后的鲢开展拯救实验，20±5 min后鲢开始正常游动，Real-time PCR检测从鲢窒息到拯救180 min过程中脑中HSP70的表达显示，拯救15 min、30 min时，脑中HSP70表达量显著高于窒息时的水平(P＜0.05)，而在拯救45 min到180 min的过程中，鲢脑中HSP70的表达量与窒息时的水平无明显差异，说明HSP70在鲢从窒息状态恢复到正常游动过程中起到了一定的作用。

目录

声明

摘要

缩略语表

第一章 前言

1．1 鲢的生物学特性及育种研究

1．2 细胞骨架蛋白

1．2．1 细胞骨架蛋白介绍

1．2．2 外界环境应激对细胞骨架蛋白的影响

1．3 热休克蛋白

1．3．1 热休克蛋白简介

1．3．2 环境应激对鱼类热休克蛋白70的影响

1．4 低氧对鱼类的影响

1．5 技术路线

1．6 实验试剂及仪器

1．6．1 主要试剂

1．6．2 实验仪器

1．6．3 研究目的及意义

第二章 鲢两个微管蛋白基因全长的克隆及表达分析

1．1 材料与方法

1．1．1 实验材料

1．1．2 组织中总RNA的提取

1．1．3 总RNA反转录

1．2 实验方法

1．2．1 DM-domain区扩增

1．2．2 鲢TUB84和TUBA2基因全长扩增

1．2．3 PCR产物回收

1．3 结果与分析

1．3．1 鲢TUB84和TUBA2基因的生物信息学分析

1．3．2 TUB84和TUBA2的基因表达分布

1．3．3 低氧胁迫下TUBA2和TUB84的mRNA表达变化分析

1．4 讨论

第三章 鲢诱导型HSP70cDNA的克隆及表达分析

1．1 材料与方法

1．1．1 材料

1．1．2 总RNA的提取

1．1．3 酚氯仿法提取DNA

1．1．4 DNA纯度检测

1．1．5 引物设计

1．2 方法

1．2．1 鲢HSP70基因全长扩增

1．2．2 序列分析和同源性比较

1．2．3 HSP70基因翻译区有无内含子的检验

1．2．4 半定量RT-PCR检测HSP70 mRNA的表达分布

1．3 结果与分析

1．3．1 鲢HSP70cDNA全长及序列分析

1．3．2 氨基酸序列比对及系统进化树分析

1．3．3 鲢HSP70基因翻译区有无内含子的检测结果

1．3．4 HSP70 mRNA在鲢各组织中的表达

1．3．5 低氧胁迫下鲢HSP70mRNA在各组织中的表达变化

1．4 讨论

1．4．1 鲢HSP70cDNA的克隆及序列分析

1．4．2 鲢HSP70cDNA内含子的验证及组织分布

1．4．3 低氧胁迫下鲢HSP70cDNA在各组织中的表达

第四章 低氧胁迫下两种热休克蛋白70的表达变化

1．1 材料与方法

1．1．1 材料

1．1．2 ELISA检测低氧胁迫下HSP70和HSC70的蛋白表达

1．2 结果与分析

1．2．1 低氧胁迫下HSC70和HSP70在鲢心脏中的表达变化

1．2．2 低氧胁迫下HSC70和HSP70在鲢脑中的表达变化

1．2．3 低氧胁迫下HSC70和HSP70在鲢肝脏中的表达变化

1．2．4 低氧胁迫下HSC70和HSP70在鲢脾中的表达变化

1．2．5 低氧胁迫下HSC70和HSP70在鲢肾中的表达变化

1．2．6 低氧胁迫下HSC70和HSP70在鲢肌肉中的表达变化

1．2．7 鲢窒息后拯救过程中脑中HSP70的表达变化

1．3 讨论

参考文献

致谢

硕士期间发表的主要论文

附录