禁食-恢复投喂条件下鲢神经肽Y及三个瘦素相关基因的表达分析

摘要

摄食和能量代谢对鱼类的生长至关重要，不适当的摄食和能量代谢会抑制动物生长、延缓青春期、降低动物免疫力，甚至引起动物死亡。而在自然界中，由于各种因素的影响，常常导致鱼类在其生活周期面临食物资源的缺乏而受到饥饿胁迫。瘦素(leptin，LEP)和神经肽Y(neuropeptide Y，NPY)是动物食欲调节系统中两个主要的因子，二者相互作用调节动物的摄食和能量代谢。
　　鲢（Hypophthalmichthys molitrix）隶属于鲤形目（Cypriniformes）、鲤科(Cyprinidae)、鲢属（Hypophthalmichthys），是我国传统养殖的“四大家鱼”之一，在我国分布广泛，年产量高，具有重要的经济价值。本文以鲢为研究对象，开展了其神经肽Y(neuropeptide Y，NPY)基因及三个瘦素相关基因(leptin，LEP; leptinreceptor, LEPR; leptin receptor overlapping transcript，LEPROT)的克隆，组织表达检测以及在禁食—恢复投喂条件下这四个基因在鲢脑和肝脏中的表达特征分析，从分子水平初步探讨NPY和LEP对鲢摄食和能量代谢的调节作用。本研究的主要实验结果如下:
　　1.鲢神经肽Y(NPY)基因的克隆及其在禁食—恢复投喂条件下的表达特征分析鲢NPY基因cDNA序列全长782 bp，包括5'端非翻译区68 bp，3'端非翻译区423 bp，开放阅读框291 bp，编码96个氨基酸;氨基酸相似性比较和系统进化分析结果显示NPY较为保守;NPY在所检测的13个组织中均有表达，并且在脑垂体中表达量最大;禁食导致NPY mRNA在脑中的表达量显著上升，恢复投喂6h后下降到正常水平，表明NPY对鲢摄食有促进作用;在肝脏中，禁食前5d NPY mRNA表达量显著上升，禁食第7d急剧下降，恢复投喂4h后下降到正常水平，NPY mRNA在脑和肝脏中表达的组织差异性表明NPY在外周组织中发挥着与在神经系统中不同的作用，但在外周组织中的具体作用机制有待进一步研究。
　　2.鲢瘦素相关三个基因的克隆及其在禁食—恢复投喂条件下的表达特征分析鲢LEPR基因cDNA序列全长为3662 bp，包含3240 bp的开放阅读框，编码1079个氨基酸残基;LEPROT基因cDNA序列全长718 bp，开放阅读框393 bp，编码130个氨基酸残基;氨基酸序列相似性比较表明LEP和LEPR基因在分子进化过程中不保守，与人LEP和LEPR的氨基酸序列同源一致性仅为20.2％和25.9％，LEPROT基因相对较保守;进化树分析显示硬骨鱼类LEP、LEPR和LEPROT基因均从四足类分化而来;LEP主要在肝脏中表达，LEPR和LEPROT在所检测的13种组织中几乎都表达，但在脑垂体中表达量最大;在脑中，禁食期间，LEP、LEPR和LEPROTmRNA的表达显著上升，恢复投喂之后急剧下降到基础水平;肝脏中，3个基因mRNA的表达各异，但各基因的整体表达趋势均在禁食—恢复投喂期间有一段下降的过程。
　　本研究所检测到的鲢中LEP、LEPR和LEPROT在禁食—恢复投喂条件下的表达变化与已有的哺乳动物和其它一些硬骨鱼类的调节模式存在一定的差异，查阅相关资料和文献，发现LEP在硬骨鱼类中调节食欲和能量代谢的模式存在多样性，并且大部分与哺乳动物的调控模式不同，推测鱼类中这种LEP调控模式的多样性与不同鱼类的食性相关。本研究为探讨NPY、LEP等基因在鲢中的生物学功能和在遗传育种中的作用提供了理论依据，为今后筛选鲢强摄食品种打下基础。

目录

声明

摘要

缩略语表

第一章 前言

1．1 鲢的生物学特性及资源现状

1．2 鱼类育种技术的发展

1．3 鱼类食欲调控的重要性

1．4 NPY

1．4．1 NPY简介

1．4．2 NPY促进动物摄食

1．4．3 NPY促摄食的发生路径

1．5 LEP、LEPR和LEPROT

1．5．1 LEP简介

1．5．2 LEP对能量代谢的调节作用

1．5．3 LEP对动物摄食的调节作用

1．5．4 LEP与NPY的交互作用

1．5．5 影响LEP分泌和表达的因素

1．5．6 LEPR简介

1．5．7 LEPROT简介

1．6 研究目的及意义

1．7 技术路线

第二章 鲢神经肽Y基因的克隆及其在禁食-恢复投喂条件下的表达特征分析

2．1 前言

2．2 材料与方法

2．2．1 实验材料

2．2．2 实验方法

2．3 结果

2．3．1 鲢NPY基因序列分析

2．3．2 鲢NPY基因的同源性分析和系统进化树构建

2．3．3 鲢NPY基因组织表达谱

2．3．4 禁食-恢复投喂对鲢脑和肝脏中NPY表达的影响

2．4 讨论

2．4．1 鲢NPY基因cDNA序列分析

2．4．2 鲢NPY基因组织表达分析

2．4．3 禁食-恢复投喂对鲢NPY表达的影响

第三章 鲢瘦素相关三个基因的克隆及其在禁食—恢复投喂条件下的表达特征分析

3．1 前言

3．2 材料与方法

3．2．1 引物

3．2．2 标准曲线

3．3 结果

3．3．1 鲢LEP、LEPR和LEPROT基因序列分析

3．3．2 鲢LEP、LEPR和LEPROT基因的系统进化分析

3．3．3 鲢LEP、LEPR和LEPROT基因的组织表达分析

3．3．4 禁食—恢复投喂对脑LEP、LEPR和LEPROT mRNA表达的影响

3．3．5 禁食—恢复投喂对肝脏LEP、LEPR和LEPROT mRNA表达的影响

3．4 讨论

3．4．1 鲢LEP、LEPR和LEPROT基因cDNA序列分析

3．4．2 鲢LEP、LEPR和LEPROT基因组织表达分析

3．4．3 禁食—恢复投喂对鲢LEP、LEPR和LEPROT mRNA表达的影响

第四章 结语

参考文献

硕士期间发表的论文

致谢