牛分枝杆菌和卡介苗对树突状细胞及CD4+T细胞分化的影响

摘要

结核病防控是一个世界性难题，据统计全球三分之一的人都感染了结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，M.tb），其中大部分属于隐性感染，只有少部分发病，但是每年有约870万的新发病例。结核分枝杆菌能通过空气传播，并且能在环境中长久存活。结核分枝杆菌是一种胞内寄生菌，能够感染树突状细胞和巨噬细胞等免疫递呈细胞，并且能够抑制免疫细胞对它的处理，在抗原递呈细胞中存活，并且随着抗原递呈细胞的转移而扩散，导致持续感染，但其免疫抑制和持续感染的分子机制不完全清楚。
　　 牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis，M.bovis)与结核分枝杆菌基因同源性为99.95％，是牛结核病的主要病原菌。不仅能感染牛，同时能感染人和多种野生动物。野生动物成为带菌者和散播者，使牛结核病的防控工作更加艰巨。牛分枝杆菌和结核分枝杆菌在体内引起相似的致病过程。
　　 卡介苗(BCG)是牛分枝杆菌经过体外传代230代得到的弱毒菌，广泛用于预防结核病，儿童接种后能有效的产生免疫保护效应。所以，研究强弱牛分枝杆菌菌株在机体内的免疫反应差异有助于阐明结核病的免疫抑制和持续感染的分子机制。
　　 树突状细胞（Dendritic cells，DCs）是体内专职的抗原递呈细胞，是联接先天免疫和获得性免疫的桥梁，同时也是结核分枝杆菌宿主细胞。本研究以树突状细胞为模式细胞，研究牛分枝杆菌和BCG感染诱导的差异反应，及其对CD4+T分化的影响，以期为阐明结核病的免疫抑制和持续感染的分子机制提供重要依据。取得如下研究结果:
　　 (1)牛分枝杆菌和BCG感染DCs后，BCG诱导产生了更高浓度的IL-12，TNF-α，RANTES和MCP-1;而牛分枝杆菌则诱导产生了更高浓度的IL-1β和IL-23。提示BCG感染诱导产生Th1型细胞因子和趋化因子，有利于产生更为有效的免疫保护反应;牛分枝杆菌则诱导更高水平的炎性细胞因子，反应过度时将发生炎性损伤反应。
　　 (2)灭活细菌与活细菌感染DCs后，活细菌诱导产生的细胞因子与趋化因子都高于灭活细菌诱导产生的，说明活细菌感染对有效诱导DCs反应是必须的。
　　 (3) NF-κB抑制剂PDTC能够抑制M.bovis和BCG感染DCs诱导的细胞因子表达，表明其受NF-κB转录因子的调控。
　　 (4)牛分枝杆菌和BCG感染DCs、无细胞培养液（含细胞因子）和感染后DCs细胞培养物（感染DCs+细胞因子）分别与幼稚型CD4+T细胞互作，检测细胞因子以及流式细胞术检测细胞的分化情况，结果表明:BCG感染的DCs能诱导T细胞产生较多的IFN-γ，而牛分枝杆菌诱导更多的IL-10和IL-17;细胞流式细胞仪检测表明，牛分枝杆菌诱导更多的CD25+Foxp3+双阳性Treg细胞，而活细菌及灭活细菌都不能直接刺激CD4+T细胞的分化。以上结果提示:BCG倾向于诱导Th1型细胞的分化，而牛分枝杆菌倾向于诱导更多Th17和Treg型细胞的分化。Th1型细胞将产生免疫保护反应，而Th17和Treg型细胞则与炎性反应和免疫抑制有关。这些结果对阐明结核分枝杆菌诱导免疫免疫和持续感染的分子机制具有重要意义。

目录

论文说明

声明

摘要

缩略语表(Abbreviation)

1 前言

1．1 研究问题的由来

1．2 文献综述

1．2．1 结核分枝杆菌感染过程

1．2．2 结核分枝杆菌感染巨噬细胞

1．2．3 结核分枝杆菌感染树突状细胞

1．2．4 结核分枝杆菌的免疫逃避机制

1．2．5 BCG的免疫反应

1．2．6 T细胞在结核病中的免疫研究

1．3 研究目的与意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 菌种及实验动物

2．1．2 小鼠骨髓源性树突状细胞

2．1．3 培养基

2．1．4 主要试剂

2．1．5 主要试剂配方

2．1．6 主要仪器

2．1．7 鉴定分枝杆菌复合群的PCR引物

2．2 细菌的准备

2．2．1 牛分枝杆菌和BCG的培养，鉴定，计数与灭活

2．2．2 PCR鉴定细菌

2．2．3 PCR对结核分枝杆菌复合群的定型鉴定标准

2．2．4 金胺O染色鉴定细菌的生存状态

2．3 树突状细胞的培养与鉴定

2．3．1 树突状细胞的培养

2．3．2 流式细胞术鉴定树突状细胞

2．4 不同毒力型牛分枝杆菌感染树突状细胞模型的建立

2．5 感染后树突状细胞细胞因子的检测

2．6 抗酸染色检测感染树突状细胞的牛分枝杆菌和BCG

2．7 扫描电镜检测树突状细胞对牛分枝杆菌和BCG的吞噬作用

2．8 小鼠脾脏中CD4+T细胞的分离纯化

2．9 感染的树突状细胞对CD4+T细胞分化的影响

2．10 流式细胞术检测CD4+Treg细胞

3 结果

3．1 牛分枝杆菌和BCG的鉴定

3．1．1 PCR鉴定BCG与牛分枝杆菌

3．1．2 金胺O染色鉴定细菌存活状态

3．2 小鼠骨髓源性树突状细胞的鉴定

3．2．1 骨髓干细胞中的树突状细胞比例

3．2．2 未成熟树突状细胞的鉴定

3．3 树突状细胞感染M．bovis和BCG模型建立

3．3．1 抗酸染色鉴定细菌与细胞结合与吞噬

3．3．2 扫描电镜观察树突状细胞对细菌的吞噬

3．3．3 树突状细胞感染细菌后MHC-Ⅱ分子的表达

3．4 感染后树突状细胞细胞因子测定

3．4．1 不同毒力牛分枝杆菌感染树突状细胞检测细胞因子

3．4．2 NF-κB信号通路阻断检测细胞因子

3．4．3 TLRs阻断对DC感染后细胞因子分泌的影响

3．5 牛分枝杆菌／BCG感染树突状细胞对CD4+T细胞分化的调节

3．5．1 CD4+T细胞磁珠分选效果检测

3．5．2 感染的树突状细胞对CD4+T细胞细胞因子分泌的调节

3．5．3 流式检测Treg细胞

4 讨论

4．1 牛分枝杆菌和BCG差异性诱导DCs分泌细胞因子及趋化因子

4．2 牛分枝杆菌与BCG感染DCs诱导不同的CD4+T细胞亚群的分化

4．2．1 Th17细胞在结核感染中的作用

4．2．2 Th1型细胞在结核感染中的作用

4．2．3 Treg细胞在结核感染中的作用

5 结论

参考文献

致谢