斑马鱼HIF-1α启动子活性分析及LPS和低氧对HIF-1α的诱导表达

摘要

低氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)是在低氧环境下广泛表达的真核细胞转录因子，在调节新陈代谢、发育、细胞存活、增殖和病理状况下都发挥着重要作用。目前对于HIF-1α的研究多集中于哺乳动物的心脑血管疾病、肿瘤、胚胎发育等生理病理方面，而鱼类与哺乳动物相比更容易受到低氧胁迫和污染的侵害，但是关于鱼类HIF-1α的调节机制却知之甚少。在本研究中，以模式生物斑马鱼（Danio rerio）为研究对象，对斑马鱼HIF-1α启动子进行生物信息学分析，构建一系列启动子缺失体的真核表达载体分析启动子活性，并研究LPS（lipopolysaccharide）和低氧对HIF-1α基因表达的调节，探究鱼类低氧、炎症适应的分子机制。主要结果如下:
　　 1、斑马鱼HIF-1α基因启动子的生物信息学分析
　　 通过生物学信息学软件对斑马鱼HIF-1α启动子进行分析，genomatix的gene2promoter程序预测在-651 bp至+102 bp处是启动子区域，结合这个结果我们通过设计引物，选择-1578至+97的1675 bp启动子序列进行下一步研究。CpG Island Searcher预测CpG岛位于-97 bp至+403 bp处，MethPrime预测CpG岛位于-173 bp至+38 bp处，显示斑马鱼HIF-1α含有CpG岛。对所选1675 bp启动子区进行转录因子预测发现其包括保守的调节元件CEBP(essential regulation elements CCAAT/enhancerbinding protein)、STAT(signal transducer and activator of transcription)和E-box(enhancer box)，以及应激炎症应答元件CREB(cAMP-responsive element bindingproteins)、HSF(heat shock factors)和NF-κB(nuclear factor kappa B)等。通过对鲤科鱼类近端240 bp序列进行比对发现其相似性高于82％。将转录因子进行比对后发现它们共同享有CAAT(CCAAT binding factors)、STAT、HIFF(hypoxia induciblefactor)等转录因子。
　　 2、斑马鱼HIF-1α基因启动子缺失突变体的构建与活性分析
　　 设计引物通过PCR扩增斑马鱼HIF-1α系列启动子片段，常规分子生物学方法构建启动子的真核表达载体并进行启动子活性分析测定。结果成功构建6个不同长度的启动子真核表达载体。双荧光素酶测定结果显示最高的启动子荧光活性存在于pGL1-1中;但当转染pGL1-2和pGL1-3后荧光活性却几乎消失，说明-127到+97之间的序列很关键;当转染pGL2-1，pGL2-2和pGL2-3这些包含-127到+97序列的质粒后显示出很好的启动活性;说明我们所构建的最小启动子缺失体pGL2-3(-134至+97)包含最小核心启动子区。对-134至+97序列进行分析后发现此区间中存在很多顺势作用元件，例如E-box，CEBP，STAT，HSF，CREB等;在-1578到-930之间可能存在负性调控元件IRF(Interferon regulatory factor)和PRDI(positive regulatorydomain I binding factor)。
　　 3、LPS及低氧对斑马鱼HIF-1α基因转录水平的调节
　　 常氧下用1μg/mL的LPS处理转染后的细胞后发现，只有pGL2-2和pGL2-3两个缺失体的活性有显著上升，其他缺失体的活性则没有明显变化，说明LPS在常氧下对HIF-1α的启动子活性并没有显著影响。常氧下用不同浓度的LPS处理斑马鱼幼鱼(3 dpf)6h后发现，HIF-1α的mRNA水平在任何一个浓度范围内都没有显著变化。结果表明常氧下，在体内研究中LPS对HIF-1α的转录水平也没有显著影响。低氧下用不同浓度的LPS处理3dpf斑马鱼幼鱼后发现，仅在低氧条件下HIF-1α的mRNA水平仍然没有显著变化。而在加入了各浓度的LPS后发现HIF-1α mRNA表达量随着LPS的浓度开始不断上升，10μg/mL的LPS显著激活了HIF-1α的mRNA水平。在时间进程实验中，低氧下用10μg/mL LPS处理斑马鱼幼鱼不同时间后，HIF-1αmRNA表达量在处理后3h开始缓慢上升，在第8h时上升到一个高峰。推测LPS和低氧在调节斑马鱼HIF-1α转录活性上存在一种协同机制。这种协同机制与鱼类的生存环境密切相关，因此更有益于鱼类的生存。

目录

声明

摘要

缩略语表

第一章 前言

1 低氧诱导因子研究概况

1．1 低氧诱导因子1的发现

1．2 低氧诱导因子α的家族

1．3 氧对HIF-1α亚基的调节

2 HIF-1α的功能

2．1 HIF-1α与新陈代谢适应

2．2 HIF-1α与胚胎发育

2．3 HIF-1α与炎症反应

3 低氧诱导因子1α在鱼类中的概况

4 本研究的目的与意义

第二章 斑马鱼HIF-1α基因启动子的生物信息学分析

1 材料与方法

1．1 HIF-1α基因启动子序列的获取

1．2 DNA片段的启动子预测

1．3 DNA片段CpG岛的分析

1．4 转录起始位点预测

1．5 HIF-1α基因5’侧翼序列转录因子结合位点分析

1．6 鲤科鱼类HIF-1α基因5’侧翼区序列对应比对

2 结果

2．1 启动子序列预测结果

2．2 CpG岛预测结果

2．3 转录起始位点预测结果

2．4 转录因子结合位点预测结果

2．5 鲤科鱼类HIF-1α基因5’侧翼区序列对应比对结果

3 讨论

第三章：斑马鱼HIF-1α及基因启动子缺失突变体的构建与活性分析

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

2 结果

2．1 斑马鱼基因组DNA的抽提

2．2 斑马鱼HIF-1α基因系列截短突变体的5’侧翼序列PCR扩增

2．3 斑马鱼HIF-1α基因系列5’侧翼序列系列荧光素酶报告基因表达载体的构建、测序及PCR鉴定

2．4 斑马鱼HIF-1α及基因系列5’侧翼序列系列截短缺失体的荧光素酶报告基因表达载体的活性测定

3．讨论

第四章 LPS及低氧对斑马鱼HIF-1α基因转录水平的调节

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

2 结果

2．1 常氧下LPS处理对HIF-1α系列启动子缺失体活性的影响

2．2 常氧下LPS处理斑马鱼仔鱼对HIF-1α基因转录水平的影响

2．3 低氧和LPS处理斑马鱼仔鱼对HIF-1α基因转录水平的影响

3 讨论

参考文献

致谢