乙型脑炎病毒感染小胶质细胞中TLR3、RIG-I信号通路分析研究

摘要

乙型脑炎(Japanese encephalitis，JE)是由日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitisvirus，JEV)引起的一种人畜共患病，患者多表现为发热、腹泻、头痛、恶心、意识水平下降、颤抖以及行动异常等，而猪群受感染后表现为明显生殖障碍。靶向中枢神经系统，引发中枢神经系统炎症反应，是乙型脑炎病毒导致人和动物发病、死亡的主要因素。而小胶质细胞过度激活及其诱导的大量炎症因子分泌，则是JEV引发脑部炎症反应的重要途径。但JEV通过何种信号通路激活小胶质细胞，其分子机制如何等科学问题仍不清楚。
　　 本研究首先从TLR3和RIG-I信号通路入手，研究了JEV感染小鼠小胶质细胞之后炎症因子的表达、信号通路的激活情况。
　　 具体研究内容如下:
　　 以小鼠小胶质细胞系BV-2为体外模型，研究了乙型脑炎病毒在该细胞中的增殖情况，发现该病毒可以感染BV-2，但在该细胞中的增殖滴度较低，荧光定量检测C基因拷贝数在48h内增加不超过10倍。经荧光定量PCR与ELISA方法检测，乙型脑炎病毒感染能有效刺激细胞因子、趋化因子如TNF-α、IL-6、CCL-2表达量显著上调;同时，Western Blot检测结果显示TLR3、RIG-I蛋白表达量因乙脑病毒刺激表现明显上调，且该病毒刺激能诱导信号通路激酶ERK、p38MAPK磷酸化蛋白及转录因子NF-κB、AP-1的核内表达量均显著上调。通过shRNA转染方法分别对TLR3和RIG-I进行干扰，观察干扰后上述指标的变化，发现:ERK、p38MAPK蛋白磷酸化、转录因子NF-κB、AP-1的核内表达以及炎症因子表达均受到了不同程度的抑制，且细胞内病毒含量增加。表明TLR3与RIG-I在乙脑病毒诱导小胶质细胞炎症反应与病毒增殖过程中起到了重要作用，且RIG-I较TLR3更显著。

目录

声明

摘要

缩略语表(Abbreviation)

文献综述

1．1 乙型脑炎的流行病学

1．1．1 乙型脑炎的流行与分布

1．1．2 乙型脑炎的危害及易感群体

1．1．3 乙型脑炎的传播

1．2 乙型脑炎的病原学

1．2．1 乙型脑炎的形态结构

1．2．2 乙型脑炎病毒的理化特性

1．2．3 乙型脑炎病毒的复制

1．3 乙型脑炎病毒的致病机理

1．3．1 病毒血症与血脑屏障

1．3．2 细胞因子与信号通路

1．4 乙型脑炎的临床表现

1．5 乙型脑炎的检测诊断

1．6 乙型脑炎的防治

1．7 研究目的与意义

2．实验材料、方法与结果分析

2．1 实验材料

2．1．1 所用的寡核苷酸引物

2．1．2 质粒、毒株、细胞与实验动物

2．1．3 主要药品及试剂

2．1．4 主要培养基及其配制

2．1．5 主要缓冲液(溶液)及其配制

2．2 实验方法

2．2．1 引物设计

2．2．2 病毒滴度测定

2．2．3 细胞培养、动物饲养及接毒

2．2．4 间接免疫荧光

2．2．5 细胞、组织样品处理

2．2．6 RNA提取与浓度测定

2．2．7 RNA处理与反转录(RT-PCR)

2．2．8 转录水平细胞因子表达差异分析

2．2．9 细胞内JEV增殖情况分析

2．2．10 TLR3与RIG-I干扰(shRNA转染)

2．2．11 Western Blot

2．2．12 蛋白水平细胞因子表达差异分析

2．2．13 数据统计

2．3 结果与分析

2．3．1 病毒增殖情况分析

2．3．2 间接免疫荧光检测

2．3．3 细胞因子表达分析

2．3．4 小鼠脑组织中细胞因子表达分析

2．3．5 TLR3、RIG-I蛋白表达分析

2．3．6 ERK、p38MAPK磷酸化蛋白表达分析

2．3．7 NF-κB、AP-1入核表达分析

2．3．8 shRNA转染与干扰效果测定

2．3．9 干扰后ERK、p38MAPK磷酸化蛋白表达分析

2．3．10 干扰后转录因子入核表达分析

2．3．11 干扰后细胞因子表达分析

2．3．12 ERK、p38MAPK抑制剂作用后细胞因子表达分析

2．3．13 干扰后JEV病毒增殖情况分析

3．讨论

3．1 JEV上调BV-2细胞炎症因子及TLR3、RIG-I蛋白表达

3．2 JEV上调BV-2细胞信号通路激酶磷酸化与转录因子入核转录

3．3 TLR3、RIG-I与乙型脑炎的炎症反应密切相关

3．4 JEV在BV-2中的增殖及其对TLR3与RIG-I的依赖性

3．5 小结

结论

参考文献

发表论文

致谢