石杉属植物内生菌的多样性及其次生代谢产物的乙酰胆碱酯酶抑制活性研究

摘要

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)，又叫老年性痴呆症，是常见频发的老年疾病之一。目前治疗AD的方法中，已经验证并得到公认的，就是通过对AChE（乙酰胆碱酯酶）起到抑制作用而达到治疗效果，即AChE抑制剂。而蛇足石杉所产次级代谢物石杉碱甲是治疗老年痴呆症的特效药物之一，与其它药物相比，具有疗效显著、作用周期短、毒副作用小、不易产生抗药性的优点。但同时石杉属植物生长速度都很缓慢，其体内均含有不同数量和种类的内生菌，若想获得高产量的植物体，无论是人工种植还是组织培养都存在很大的困难。人工合成类的药物不仅价格较贵，且有很多副作用，所以获得纯天然的高产量的AChE抑制剂就成为了非常有潜力和价值的研究。
　　 本文是从石杉属(Huperzia Bernh.)植物体中分离纯化得到215株的内生真菌，进行菌种鉴定后，合并相同菌种，并建立石杉属植物内生菌库。而后通过AChE抑制活性试验，确定对AChE有抑制活性的菌种。ESSZ05601是担子菌亚门黑粉菌纲黑粉菌目腥黑粉菌科条黑粉菌属的一种真菌。在进行检测的40个不同菌种内生菌种中，ESSZ05601的AChE抑制率为60.95％，是抑制率最高的，且高于Hup A的42.39％。在进行酶活抑制试验的同时，我们还进行了HPLC（高效液相色谱）检测，与标准品Hup A、Hup B和Hup C进行比对，找出与标准品出峰时间较为接近或相同的菌种。结果发现ESSZ05601的出峰时间与标准品完全不同，但在310hm紫外吸收波长时，只有一个单峰出现，且峰面积非常大。这表明该菌种的有效生物碱，并非是Hup A、Hup B或Hup C，但该菌的次生代谢产物极有可能成为治疗AD的有效药物。

目录

声明

摘要

缩略语表

1 前言

1．1 研究背景

1．1．1 阿尔茨海默病

1．1．2 阿尔茨海默病的治疗

1．2 研究现状

1．2．1 蛇足石杉内生菌的研究

1．2．2 真菌的形态学及分子生物学鉴定

1．2．3 乙酰胆碱酯酶抑制活性的研究

1．3 研究目的

2 石杉属植物内生菌的分离纯化与鉴定

2．1 植物材料的灭菌方法

2．1．1 供试植物材料

2．1．2 植物材料的表面灭菌

2．2 石杉属植物内生菌的分离与纯化

2．2．1 石杉属植物内生菌的分离方法

2．2．2 石杉属植物内生菌的编号原则

2．2．3 石杉属植物内生菌的保藏和建库

3 石杉属植物内生菌的菌种鉴定

3．1 形态学鉴定

3．2 分子生物学鉴定

3．2．1 总DNA的提取

3．2．2 PCR扩增体系(50μL体系)

3．3 结果与分析

3．3 讨论

4 石杉属植物内生菌次生代谢产物的活性研究

4．1 生物碱的提取

4．2 AChE抑制活性检测材料与方法

4．2．1 材料与试剂

4．2．2 试验方法

4．3 HPLC检测材料与方法

4．3．1 材料与试剂

4．3．2 试验方法

4．4 结果与分析

4．4．1 AChE抑制活性检测结果与分析

4．4．2 HPLC检测结果与分析

4．4 讨论

5 总结

参考文献

致谢

附录

附录一：论文彩图

附录二：攻读硕士学位期间发表的学术论文