低氧胁迫对鲢线粒体ATP酶活性及β、γ、δ亚基表达的影响

摘要

线粒体ATP酶是机体生命活动中供能的关键酶，它有F1和F0两部分组成，在结合状态下具有合成ATP的活性，而在分离状态下具有水解ATP的活性，ATP的水解能够驱动F1的转动，跨膜的质子流能促进F0的转动，因此ATP酶通过F1和F0两部分的有序配合，从而合成维持机体正常生命活动所需的能量供给。
　　鲢(Hypophthalmichthysmolitrix)，俗称白鲢、跳鲢、水鲢、鲢子，隶属于鲤形目（Cypriniformes），鲤科（Cyprinidae），是我国著名的四大家鱼之一，已成为我国主要养殖的淡水鱼类之一。鲢由于性情活泼，喜跳跃，耐低氧能力较差，环境剧烈变化时易发生大水面积的浮头泛塘现象，因而选育耐低氧鲢品种（系）已经成为鲢新品种选育的重要研究课题之一。低氧状态下，由于供氧不足，线粒体中的氧化磷酸化反应受阻，不能及时有效的合成ATP，造成能量代谢受阻，无法满足鱼体对ATP正常的生理需求，鱼类游动缓慢，当缺氧严重时，会导致鱼类的死亡。
　　本文旨在通过RACE技术对鲢线粒体ATP酶F1部分β、γ、δ亚基基因的克隆，采用SYBR-greenⅠ荧光定量PCR技术对其在低氧胁迫过程中鲢各组织中的表达，及通过寡霉素抑制法对鲢线粒体ATP酶活性的变化情况等进行分析，为进一步阐明鲢低氧胁迫下线粒体ATP酶及F1各亚基的反应机制提供一定的理论数据。本研究的主要实验结果如下:
　　1.低氧胁迫对鲢线粒体ATP酶活性的影响
　　随着水体溶氧(DO)的逐渐降低，鲢心脏、脑、肝、脾和肌肉中线粒体ATP酶活性均呈现先上升后降低的趋势，但不同组织中的变化情况不尽相同。当DO为3.37mg/L时脑组织中线粒体ATP酶活性达到最高值，且显著高于正常溶氧情况下的表达水平;心脏和肌肉组织在DO为2.11mg/L时ATP酶活性达到最高峰值，均显著高于正常溶氧时的表达水平;当鲢出现浮头现象时(DO:1.12mg/L)其肝和脾脏组织中线粒体ATP酶活性出现最高峰值，显著高于正常溶氧时的表达水平。
　　2.鲢线粒体ATP酶β基因cDNA的克隆及表达
　　鲢线粒体ATP酶β基因cDNA序列全长为1768bp，开放阅读框(ORF)为1557bp，编码518个氨基酸。β是一个保守基因，其氨基酸序列与鲤鱼的同源性达到了99％，与斑马鱼、青鱂、尼罗罗非鱼、红鳍东方鲀等分别为98％、98％、97％、97％。随着DO的降低，鲢心脏、脑、肝、脾和肌肉组织中F1-β基因mRNA的表达呈先升高后降低的趋势。当DO从正常溶氧降低到2.11mg/L过程中，β基因在心脏和脑中的表达量显著升高(P＜0.05)，之后随着DO的继续降低呈现急剧下降;肝、脾和肌肉中当DO降低到3.37mg/L过程中β的表达显著升高（P＜0.05），之后急剧下降(P＜0.05)。
　　3.鲢线粒体ATP酶γ基因cDNA的克隆及表达
　　鲢线粒体ATP酶γ基因cDNA序列全长1154bp，ORF为879bp，编码292个氨基酸。其氨基酸序列与斑马鱼的同源性达93％，其次与鲤、蓝鲶鱼、斑点叉尾鲴、大西洋鲑鱼等分别达92％、92％、91％、86％。随着DO的降低，在脑、肝和肌肉中γ基因的表达呈现先升高后降低的趋势，当DO为2.11mg/L时，脑和肝脏中γ基因表达量最高，显著高于正常溶氧下的表达(P＜0.05），而在肌肉中，当DO为3.37mg/L时γ表达量最高，且显著高于正常水平(P＜0.05）;心脏中γ基因的表达呈逐渐降低趋势，显著低于正常表达(P＜0.05);相反在脾中则呈现逐渐升高的趋势。
　　4.鲢线粒体ATP酶δ基因cDNA的克隆及表达
　　鲢线粒体F1-δcDNA序列全长为762bp，ORF为480bp，编码159个氨基酸。其氨基酸序列与斑马鱼的同源性最高，达到了91％，与大西洋鲑、罗非鱼、樱花钩吻鲑、红鳍东方鲀等的同源性分别为84％、85％、84％、84％。随着DO的逐渐降低，鲢F1-δmRNA的表达在心脏中呈现持续下降的趋势，且与正常溶氧情况下的表达相比，有显著差异(P＜0.05);在脑、肝、脾和肌肉中的表达先呈现上调现象，且与正常DO下的表达有显著差异（P＜0.05），随后表达下调与正常DO组无显著差异，其中在肝和脾组织中当其表达量达到最高时，显著(P＜0.05)高于正常DO组数十倍。
　　5.ATP酶活性与F1复合体中β、γ、δ亚基的关系
　　由以上实验结果可知鲢线粒体ATP酶F1复合体中β、γ、δ亚基均具有高度的保守性，ATP酶中具有催化作用的β亚基，随着DO的逐渐降低，其表达变化与ATP的活性的活性的变化一致，β亚基的表达变化可反应出ATP酶活性的变化。γ、δ亚基的表达均受到DO降低的影响，其表达变化与ATP酶活性的变化在一些组织中存在差异。

目录

声明

摘要

缩略语表

第一章 前言

1 鲢的生物学特征和研究现状

2 鱼类低氧胁迫的研究进展

3 线粒体ATP酶

3．1 线粒体ATP酶结构

3．2 外界环境应激对线粒体ATP酶的影响

3．3 线粒体ATP酶F1各亚基的研究现状

4．技术路线

5．本研究的目的和意义

第二章 鲢线粒体ATP酶活性分析

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

2 实验结果与分析

2．1 ATP合酶活性的测定标准曲线

2．2 低氧胁迫过程中鲢线粒体ATP酶在各组织中的活性

3 讨论

第三章 鲢线粒体ATP β基因的克隆及表达

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

2 结果与分析

2．1 鲢线粒体F1-β基因全长cDNA的获得

2．2 鲢线粒体ATP酶β亚基基因cDNA序列分析

2．3 鲢线粒体ATP酶β亚基氨基酸序列同源性分析

2．4 鲢线粒体ATP酶β亚基的生物信息学分析

2．5 鲢F1-β mRNA表达的特异性及低氧胁迫过程中的表达变化

3 讨论

第四章 鲢线粒体F1-ATP γ基因的克隆、表达

1 材料与方法

2 结果与分析

2．1 鲢线粒体ATP酶γ亚基基因cDNA全长的克隆

2．2 鲢线粒体ATP酶γ亚基基因cDNA序列分析

2．3 鲢线粒体ATP酶γ亚基的生物信息学分析

2．4 鲢线粒体ATP酶γ亚基氨基酸序列同源性分析

2．5 鲢线粒体ATP酶γ基因表达特征分析

3 讨论

第五章 鲢线粒体F1-ATP δ基因的克隆与表达

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 试验方法

2 结果与分析

2．1 鲢F1-δ基因全长cDNA全长的获得

2．2 鲢线粒体F1-δ基因cDNA序列分析

2．3 氨基酸序列比对及系统进化树分析

2．4 鲢F1-δ蛋白质的理化性质、结构域及信号肽分析

2．5 鲢F1-δ mRNA表达的组织特异性及低氧胁迫过程中的表达变化

3 讨论

参考文献

致谢

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