黄曲霉菌特异单链抗体及其基因的分离鉴定和应用

摘要

黄曲霉菌（Aspergillusflavus）是一种重要的植物病原真菌，造成玉米、花生、棉花等多种农作物的减产和粮食的霉变，导致重大的经济损失。黄曲霉菌也是一种重要的人和动物致病菌引起严重的曲霉病。黄曲霉菌和寄生曲霉菌（Aspergillusparasiticus）产生的次级代谢产物黄曲霉毒素(aflatoxin)是一种剧毒的真菌毒素，具有强烈地致癌和致畸作用。被黄曲霉菌污染的农产品中通常有大量的黄曲霉毒素残留，被人和动物误食会导致严重的中毒事件，长期摄入会诱发肝癌等疾病，严重威胁人和动物的健康。因此对黄曲霉菌进行快速、灵敏地检测对于预防黄曲霉菌引起的动植物病害，监测黄曲霉毒素的污染具有重要的意义。
　　免疫学检测技术利用了抗体和抗原之间的特异性互作，已经被广泛应用于各种病原菌的快速诊断。传统的免疫学检测方法主要利用多克隆抗体和单克隆抗体，但这2种抗体的制备依赖于动物免疫和杂交瘤细胞融合技术，生产成本较高。利用噬菌体展示技术可以从抗体文库中筛选到高亲和力单链抗体，并且同时获得抗体的编码基因。单链抗体具有易于原核表达和基因工程改造等优点，在免疫学检测领域中有显著的优势。本研究以黄曲霉菌细胞壁蛋白为靶标，选到了高亲和力单链抗体，所取得的主要成果如下:
　　1.将黄曲霉细胞壁蛋白免疫小鼠，通过杂交瘤细胞融合技术筛选到了4株黄曲霉菌特异单克隆抗体杂交瘤细胞。对4种从小鼠腹水中纯化的单克隆抗体进行了ELISA分析，结果表明mAb2A8抗体对黄曲霉细胞壁蛋白的亲和力最高，可以用于免疫学检测。
　　2.将黄曲霉细胞壁蛋白免疫鸡，构建了库容量为1.2×107的鸡源单链抗体文库，并利用噬菌体展示技术对抗体文库进行了筛选。通过表达ELISA从筛选后的单链抗体文库中鉴定出了35个阳性克隆，对所属的4种类型高亲和力抗体AfSA4、AfSA5、AfSA8和AfSD10进行原核表达和纯化。
　　3.对筛选到的单链抗体氨基酸序列进行分析，结果表明抗体CDR区序列的组成和长度存在较大差异。间接ELISA分析表明AfSA4对黄曲霉菌和寄生曲霉菌的亲和力最高。对AfSA4、AfSA5、AfSA8和AfSD10的空间结构进行了预测，结构比较分析表明AfSA4的L-CDR2和H-CDR3结构域之间存在氢键等紧密的相互作用，该部位独特的致密空间结构可能与AfSA4的高亲和力密切相关。免疫荧光分析表明AfSA4可以与黄曲霉和寄生曲霉细胞壁表面结合，而AfSA5、AfSA8和AfSD10不能识别细胞壁表面。免疫印迹分析也迸一步证明了不同单链抗体之间存在抗原识别特性的差异。
　　4.利用phageELISA方法对淘选后的抗体文库进行鉴定，对筛选到的阳性克隆序列进行了分析，并与表达ELISA的鉴定结果进行比较。从中筛选到了高亲和力单链抗体AfPD12，并进行原核表达和纯化。免疫荧光实验证明AfPD12识别黄曲霉和寄生曲霉细胞壁表面抗原。免疫印迹实验证明AfPD12识别细胞壁蛋白。
　　5.将AfSA4和AfPD12与碱性磷酸酶(AP)构建成融合蛋白AfSA4-AP和AfPD12-AP，并进行原核表达和纯化。ELISA和免疫印迹分析表明scFv抗体和scFv-AP融合蛋白具有相同抗原识别特性，特异性识别曲霉属病原真菌。表面等离子共振(SPR)分析表明AfSA4-AP亲和力比AfSA4提高了约6倍，AfPD12-AP亲和力比AfPD12提高了约14倍。间接ELISA实验表明scFv-AP融合蛋白检测抗原的灵敏度更高。
　　6.将AfPD12与生物素化标签蛋白构建了Bio-AfPD12融合蛋白，并进行原核表达和纯化。Westernblot分析表明链霉亲和素特异性识别原核表达的Bio-AfPD12证明Bio-AfPD12被成功生物素化。间接ELISA实验表明Bio-AfPD12能够用于检测黄曲霉菌和寄生曲霉菌。
　　7.利用包被抗体mAb2A8和检测抗体AfSA4-AP建立了夹心ELISA(ds-ELISA)检测体系，可以同时对黄曲霉菌和寄生曲霉菌进行高灵敏度检测，对两者的最低检测限达到10-3μg/mL。在玉米和花生基质中对两种真菌检测的灵敏度达到1μg/g。该检测方法对健康的玉米、花生材料和非曲霉属的常见植物病原真菌没有交叉反应，可以用于对黄曲霉毒素产生菌的免疫学检测。
　　8.利用包被抗体AfPD12和检测抗体AfPD12-AP建立的ds-ELISA可以检测黄曲霉菌和寄生曲霉菌，灵敏度达到10-2μg/mL，该方法可以避免对单克隆抗体的使用。利用AfPD12和Bio-AfPD12建立了夹心荧光免疫吸附(ds-FLISA)检测方法，对黄曲霉菌和寄生曲霉菌的检测灵敏度为10-1μg/mL。
　　综上所述，本研究利用噬菌体展示技术筛选得到了多种类型黄曲霉菌特异单链抗体，并从空间结构和免疫识别等多个方面对抗体的特性进行了分析。将高亲和力单链抗体构建了scFv-AP和Bio-scFv融合蛋白，获得了双功能抗体融合蛋白。将单克隆抗体、单链抗体及其融合蛋白相互结合建立了ds-ELISA和ds-FLISA检测方法。本研究建立的免疫学检测方法可以对黄曲霉毒素产生菌进行有效检测，对保障农作物生产和食品生产安全具有重要的意义。

目录

声明

摘要

缩略词表

1 文献综述

1．1 黄曲霉菌

1．1．1 黄曲霉菌的分布和危害

1．1．2 黄曲霉菌病害的侵染循环及发生流行

1．1．3 黄曲霉菌的致病因子

1．1．4 黄曲霉菌的防治

1．2 黄曲霉毒素

1．2．1 黄曲霉毒素的来源及危害

1．2．2 黄曲霉毒素的生物合成

1．2．3 黄曲霉毒素的毒理学研究

1．3 单克隆抗体

1．3．1 免疫球蛋白概述

1．3．2 单克隆抗体研究进展

1．3．3 单克隆抗体的应用

1．4 基因工程抗体

1．4．1 基因工程概述

1．4．2 双功能抗体和双特异抗体

1．4．3 单链抗体表达系统

1．5 噬菌体展示与重组抗体库

1．5．1 丝状噬菌体介绍

1．5．2 噬菌体展示介绍

1．5．3 噬菌体抗体库介绍

1．6 黄曲霉菌检测方法

2 研究目的和意义

3 黄曲霉菌特异单克隆抗体的筛选

3．1 实验材料

3．1．1 菌株、细胞株

3．1．2 实验动物

3．1．3 主要试剂和耗材

3．1．4 试剂配制

3．1．5 仪器设备

3．2 实验方法

3．2．1 抗原制备

3．2．2 动物免疫

3．2．3 抗血清效价检测

3．2．4 骨髓瘤细胞培养

3．2．5 饲养层细胞制备

3．2．6 免疫脾淋巴细胞制备

3．2．7 细胞融合

3．2．8 杂交瘤细胞的筛选

3．2．9 杂交瘤细胞亚克隆

3．2．10 杂交瘤细胞的冻存

3．2．11 杂交瘤细胞的复苏

3．2．12 单克隆抗体的生产

3．2．13 单克隆抗体的纯化

3．2．14 单克隆抗体SDS-PAGE电泳检测

3．2．15 单克隆抗体亲和力的鉴定

3．3 结果与分析

3．3．1 黄曲霉细胞壁蛋白制备

3．3．2 免疫后抗血清滴度检测

3．3．3 杂交瘤细胞建株

3．3．4 大量生产单克隆抗体

3．3．5 纯化后单克隆抗体效价测定

3．4 讨论

3．4．1 黄曲霉菌抗原的制备

3．4．2 黄曲霉菌特异单克隆抗体的筛选

4 黄曲霉菌特异单链抗体的筛选

4．1 实验材料

4．1．1 菌株及质粒

4．1．2 实验动物

4．1．3 主要试剂和耗材

4．1．4 培养基及抗生素的配制

4．1．5 缓冲液的配制

4．1．6 引物序列

4．1．7 主要仪器设备

4．2 实验方法

4．2．1 抗原制备

4．2．2 动物免疫及多抗制备

4．2．3 抗血清效价检测

4．2．4 单链抗体基因克隆

4．2．5 单链抗体基因鉴定

4．2．6 单链抗体基因文库构建

4．2．7 单链抗体噬菌体展示库的构建和淘选

4．2．8 特异性单链抗体鉴定

4．2．9 单链抗体的表达与纯化

4．2．10 单链抗体的亲和力比较

4．2．11 单链抗体空间结构模拟

4．2．12 免疫荧光分析

4．2．13 噬菌体展示库的重新淘选

4．2．14 重新淘选后特异性单链抗体鉴定

4．3 结果与分析

4．3．1 动物免疫及IgY多抗制备

4．3．2 单链抗体基因克隆

4．3．3 单链抗体基因鉴定

4．3．4 单链抗体基因文库构建

4．3．5 ScFv噬菌体展示库的淘选

4．3．6 特异性单链抗体鉴定

4．3．7 单链抗体的表达与纯化

4．3．8 黄曲霉菌特异单链抗体亲和力比较

4．3．9 黄曲霉菌特异单链抗体空间结构模拟

4．3．10 免疫荧光分析

4．3．11 单链抗体噬菌体展示库再淘选

4．4 讨论

4．4．1 鸡单链抗体库的特点

4．4．2 鸡单链抗体库的构建和筛选

4．4．3 单链抗体的表达与纯化

4．4．4 单链抗体空间结构分析

5 单链抗体融合蛋白的构建及应用

5．1 实验材料

5．1．1 菌株及质粒

5．1．2 主要仪器、试剂和耗材

5．1．3 引物序列

5．1．4 缓冲液及培养基配制

5．2 实验方法

5．2．1 ScFv-AP融合蛋白的构建

5．2．2 Bio-AfPD12融合蛋白的构建

5．2．3 ScFv-AP融合蛋白表达和纯化

5．2．4 Bio-AfPD12蛋白表达和纯化

5．2．5 Bio-AfPD12融合蛋白生物素化分析

5．2．6 ScFv-AP融合蛋白活性检测

5．2．7 ScFv及scFv-AP抗原结合分析

5．2．8 表面等离子共振技术(SPR)分析抗体亲和力

5．2．9 ELISA比较scFv和scFv-AP的亲和力

5．2．10 不同抗体捕获抗原能力比较

5．2．11 夹心ELISA最低定量限(LOQ)的确定

5．2．12 夹心ELISA法检测自然发病的材料

5．2．13 Bio-AfPD12融合蛋白活性分析

5．2．14 荧光免疫吸附检测方法的建立

5．3 结果与分析

5．3．1 单链抗体与AP融合蛋白表达载体构建

5．3．2 Bio-AfPD12融合蛋白表达载体构建

5．3．3 ScFv-AP融合蛋白表达及纯化

5．3．4 Bio-AfPD12表达和生物素化分析

5．3．5 ScFv-AP融合蛋白活性检测

5．3．6 ScFv及scFv-AP抗原结合分析

5．3．7 SPR测定抗体及融合蛋白的亲和力

5．3．8 夹心ELISA检测方法的建立

5．3．9 Bio-AfPD12融合蛋白活性分析

5．3．10 夹心荧光免疫吸附检测方法的建立

5．4 讨论

参考文献

致谢

附录