华癸中慢生根瘤菌7653R效应蛋白NopP的共生功能及蛋白互作研究

摘要

根瘤菌可与豆科植物形成根瘤，这种共生关系的建立涉及根瘤菌与宿主植物之间复杂的基因表达调控、信号识别转导、分子间相互作用等过程。其中根瘤菌的Ⅲ型分泌效应蛋白在上述过程中发挥重要作用。
　　在本室前期工作中，筛选获得与华癸中慢生根瘤菌（Mesorhizobiumhuakuii)7653RⅢ型分泌效应蛋白NopP互作的紫云英宿主蛋白NIP43，通过双分子荧光互补(BiFC)技术证实了二者在烟草细胞中的蛋白相互作用。针对7653R效应蛋白NopP的共生功能及蛋白互作研究，本文取得了如下实验结果。
　　其一，植物盆栽和共生表型检测发现，相较于7653R，百脉根中慢生根瘤菌（Mesorhizobiumloti）MAFF303099也可在紫云英上结瘤，但是共生效应差。其表现为较弱的结瘤能力，叶片偏黄，植株矮小，固氮酶活偏低。然而，7653R不能与百脉根形成共生根瘤。将M.huakuii7653R的nopP基因导入MAFF303099后接种百脉根，其共生表型与接种野生型MAFF303099的植株无显著性差异。
　　其二，利用酵母双杂交技术，分别检测了广宿主根瘤菌（Rhizobiumsp）NGR234、慢生型大豆根瘤菌（Bradyrhizobiumjaponicum）USDA6以及费氏中华根瘤菌（Sinorhizobiumfredii）USDA257中的NopP同源蛋白与NIP43的互作，发现B.japonicumUSDA6的NopP与NIP43可以发生蛋白互作。
　　其三，利用插入突变技术，构建了M.huakuii7653R的nopP的失活突变株Mh-nopPmut。共生表型检测表明，突变株与宿主共生时根瘤数量减少，地上部分生物量减少，根瘤固氮酶活性无显著性差异。
　　以上结果提供了更多的实验证据显示效应蛋白NopP与宿主蛋白NIP43互作的可靠性，也考察了NopP的突变体表型，为深入研究效应蛋白NopP在结瘤中的功能及机制奠定了良好的工作基础。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 根瘤的两种基本类型

1．2 根瘤菌与豆科植物共生结瘤的过程

1．2．1 结瘤因子(nod factor)

1．2．2 根瘤菌的分泌系统(Secretion System)

1．2．1 根瘤菌分泌的效应蛋白(Secreted Proteins)

1．3 NIP43蛋白简介

1．4 研究目的与意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

1．2．1 供试菌株和质粒

2．1．2 培养基

2．1．3 酶、试剂和试剂盒

2．1．4 抗生素

2．1．5 常用缓冲液与试剂

2．1．6 PCR引物

2．2 方法

2．2．1 分子生物学基本操作

2．2．2 酵母感受态制备

2．2．3 质粒的酵母转化

2．2．4 酵母小范围mating

2．2．5 PKl9mob(Pknockout vector)单交换诱变方法

2．2．6 三亲本杂交技术

2．2．7 植物盆栽

2．2．8 固氮酶活的测定

3 结果与分析

3．1 不同供试菌株接种宿主植物紫云英及百脉根的共生表型与分析

3．1．1 MAFF303099-nopP的构建与筛选

3．1．2 M．huakuii 7653R、M．loti MAFF303099接种紫云英的共生表型

3．1．3 M．loti MAFF303099和MAFF303099-nopP接种百脉根的共生表型

3．2 NopP-NIP43蛋白相互作用研究

3．2．1 NopP及同源蛋白的序列分析

3．2．2 pGBKT7-nopP载体的构建及自激活和毒性的检测

3．2．3 载体pGADT7-nopP和pGBKT7-nip43-c-pan的构建及自激活和毒性的检测

3．2．4 同源的NopP蛋白与NIP43蛋白的相互作用

3．3根瘤菌7653R基因nopP突变株的构建

3．3．1 同源交换重组质粒Pk19-nopP的构建

3．3．2 nopP基因突变菌株的筛选

3．3．3 nopP突变株功能互补菌株的构建

3．4 华癸根瘤菌7653R nopP突变株的共生表型

3．5 华癸根瘤菌7653R基因nopP的表达检测

4 小结与讨论

4．1 小结

4．2 讨论

参考文献

致谢