柑橘多倍体愈伤组织长期继代保存过程中遗传变异的研究

摘要

柑橘愈伤组织继代保存过程中，染色体数目的变异十分普遍，而染色体缺失和增加或多倍化是最常见的情况。一般染色体数目变异会随培养时间延长而累积，然而长期的继代培养过程中，多倍体愈伤倍性组成相对保持稳定。长期继代培养的不同多倍体愈伤发现其体细胞胚胎发生能力有所不同，高倍性的愈伤丧失胚性，多倍化可能与体胚发生有一定关系。本研究旨在探寻柑橘多倍体愈伤组织中遗传变异的机制，一方面对体细胞无性系变异加以控制，为解决柑橘种质资源离体保存培养过程中的遗传不稳定现象提供重要参考:另一方面对多倍体愈伤的遗传变异和分化再生能力进行综合鉴定评估，为柑橘多倍体育种研究奠定基础。
　　本研究以继代保存多年的伏令夏橙二倍体和多倍体愈伤及新诱导的愈伤为主要材料，分别从生长分化能力、遗传稳定性和倍性变异等方面进行研究，探究柑橘多倍体愈伤组织离体保存中遗传变异，主要研究结果如下:
　　1.新诱导了伏令夏橙愈伤组织系，为研究长期继代保存的伏令夏橙多倍体愈伤组织的遗传变异研究提供对照材料。利用2-8周的幼嫩胚珠和未受精胚珠进行愈伤组织诱导，发现柑橘幼嫩胚珠更有利于诱导产生愈伤，生长素IAA和BA的共同使用对诱导愈伤产生更有利。
　　2.流式细胞术(FCM)对各种柑橘愈伤组织的倍性测定发现，同样为继代保存多年的柑橘愈伤组织，二倍体愈伤组织倍性保持相对稳定;多倍体愈伤组织倍性相对不稳定，倍性越高越不稳定。
　　3.柑橘愈伤组织的染色体观察发现，染色体数目的变异普遍，存在多倍化、整倍体和非整倍体的变异。随继代时间延长，变异增加。
　　4.SSR分子标记对柑橘愈伤组织分子多态性和变异位点进行检测，发现新诱导的愈伤组织和继代保存25年的二倍体愈伤组织遗传背景一致;121对引物检测多倍体与二倍体愈伤，多态性引物有4对，约占3.3％，其中M1-16和M9-1可以区分多倍体和二倍体。
　　5.检测了长期继代伏令夏橙愈伤不同倍性间生长速率和干物质比重。结果表明，长期继代的多倍体愈伤组织累积的变异对生长速率没有明显影响。
　　6.本研究发现，长期继代保存的柑橘多倍体愈伤体胚发生能力不同，有些柑橘愈伤组织经继代培养多年还具有体胚发生能力，更高倍性却没有。
　　综上所述，本研究从生长分化、分子水平、细胞水平对长期继代保存25年的伏令夏橙多倍体愈伤组织进行研究。在生长分化方面，倍性与生长速率没有明显关系。
　　在分子水平，多倍体愈伤与二倍体愈伤差异不明显。在细胞水平，多倍体愈伤组织倍性较二倍体更不稳定，且染色体数目变异普遍，存在整倍体和非整倍体变异。在分化能力方面，高倍性多倍体丧失胚性表明多倍化与胚发生能力有一定关系。

目录

声明

摘要

缩略词表

1 前言

1．1 课题的提出

1．2 前人研究进展

1．2．1 植物离体保存过程中的遗传变异研究进展

1．2．2 植物离体保存的体细胞胚发生研究进展

1．2．3 柑橘种质资源离体保存的研究

1．2．4 多倍体育种在柑橘上的研究进展

1．3 本研究的目的和内容

2 材料和方法

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．2．1 幼嫩胚珠的剥取与培养

2．2．2 未受精胚珠的剥取与培养

2．2．3 基因组DNA提取

2．2．4 分子标记(SSR)检测

2．2．5 倍性分析

2．2．6 染色体片制备

2．2．7 愈伤生长速率和干物质测定

2．2．8 伏令夏甜橙愈伤诱导体细胞胚的发生及再生

3 结果与分析

3．1 伏令夏橙愈伤组织的诱导

3．2 柑橘多倍体愈伤组织染色体数目测定及变异

3．2．1 流式细胞术(FCM)对伏令夏橙多倍体愈伤组织倍性分析

3．2．2 伏令夏橙愈伤多倍体倍性变异分析

3．3 柑橘不同倍性的愈伤组织SSR分子标记多态性检测

3．4 柑橘多倍体愈伤组织的生长速率与干物质比重的分析

3．5 柑橘愈伤材料的体细胞胚发生及再生

4 讨论

4．1 柑橘愈伤组织悬浮系应用

4．2 多倍体愈伤的遗传变异

4．3 长期继代保存多倍体愈伤组织分化及再生

4．4 柑橘多倍体的应用

5 未来研究设想

参考文献

致谢